Zellulärer Biolumineszenz-basierter Assay: Eine Hochdurchsatzmethode für das kombinatorische Wirkstoffscreening

Abstract

Quelle: Hu, Z. et al. Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung potenzieller Kombinationstherapien für GBM unter Verwendung von patienteneigenen Gliom-Stammzellen.J. Vis. Exp.(2021)

In diesem Video beschreiben wir eine Methode, die den Nutzen von Biolumineszenz-Assays für ein sensitives und schnelles Screening von Medikamenten hervorhebt. Diese Medikamente können allein oder in Kombination getestet werden, um den Synergismus in ihrer Wirkungsweise zu beurteilen.

Protocol

>1. Biolumineszenzbasierte Messung der Zellviabilität

1. Beschichtung der Platten mit der extrazellulären Matrix (ECM)-Mischung (z. B. Matrigel): Geben Sie 40 μl 0,15 mg/ml ECM-Mischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 1 Stunde lang bei 37 °C. Entfernen Sie die überschüssige EZM-Mischung und spülen Sie sie einmal vorsichtig mit PBS aus.
2. Geben Sie 100 μl Kulturmedium mit 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 und 500 XG387-Luc-Zellen zusammen mit 100 μl Blindmedium als Kontrolle in jede Vertiefung für 6 Replikate in einer optischen 96-Well-Bodenplatte und kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C.
3. Entfernen Sie den Überstand, geben Sie 50 μl Kulturmedium mit 150 ng/μl D-Luciferin in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C.
4. Nehmen Sie Bilder der zellulären Biolumineszenz in der Platte mit dem IVIS-Spektrum-Bildgebungssystem auf. Verwenden Sie die integrierte Software, um mehrere kreisförmige Bereiche der Region of Interest (ROI) zu erstellen und die zelluläre Biolumineszenz zu quantifizieren.

>2. Temozolomid-Behandlung und Kombinationsscreening

1. Vor der Behandlung vier 96-Well-Platten wie oben in Schritt 1 beschrieben vorbeschichten.
2. XG387-Luc-Zellen mit einer Dichte von 1.000 Zellen in 100 μl Kulturmedium in jede Vertiefung einer optischen 96-Well-Bodenplatte säen und über Nacht kultivieren.
3. Bereiten Sie Temozolomid und die Zielwirkstoffe aus der Stammlösung im Voraus vor. Bereiten Sie eine Konzentrationsreihe bestehend aus 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM und 50 μM Temozolomid in Kulturmedium für die Einzelwirkstoffbehandlung vor. Verdünnen Sie das Temozolomid und die Zielwirkstoffe in Stammlösung im Kulturmedium, um Endkonzentrationen von 200 μM bzw. 2 μM für das Kombinationsscreening von Arzneimitteln zu erhalten (Materialliste).
4. Entfernen Sie das Nährmedium, wenn die meisten GSCs an der Unterseite der Platten haften. Geben Sie das oben vorbereitete Medium, das Temozolomid enthält, in jede Vertiefung für drei technische Wiederholungen pro Behandlung.
5. Zur Behandlung von Temozolomid und zum Screening der Wirkstoffkombinationen entfernen Sie das Blindmedium und fügen Sie das oben vorbereitete Medium hinzu, das entweder 200 μM Temozolomid oder 2 μM Zielmittel oder eine Kombination aus beiden enthält, in jede Vertiefung für drei technische Replikate pro Behandlung.
6. Alle Platten 3 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren.
7. Entfernen Sie das wirkstoffhaltige Medium, geben Sie 50 μl Blindmedium mit 150 ng/μl D-Luciferin in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C.
8. Nehmen Sie Bilder der zellulären Biolumineszenz in der Platte mit dem IVIS-Spektrum-Bildgebungssystem auf. Verwenden Sie die integrierte Software, um mehrere zirkuläre ROIs zu erstellen und die zelluläre Biolumineszenz zu quantifizieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	Artikel-Nr.: 17504-044	50-mal
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100-mal
Neurobasal	Gibco	21103049	1-mal
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10.000 Einheiten/ml S: 10.000 μg/ml
Natriumpyruvat	Gibco	2088876	ca. 100 mM
ABT-737	MCE		Selektiver und BH3-mimetischer Bcl-2-Bcl-xL- und Bclw-Inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1-Hemmer
Axitinib	MCE		Multi-zielgerichteter Tyrosinkinase-Inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1-Hemmer
A 83-01	MCE		Potenter Inhibitor der TGF-β Typ-I-Rezeptor-ALK5-Kinase
CGP57380	Selleck		Potenter MNK1-Hemmer
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dualer ATPkompetitiver PI3K- und mTOR-Inhibitor
Dasatinib	MCE		Dualer Tyrosinkinase-Inhibitor der Bcr-Abl- und Src-Familie
Erlotinib	MCE		EGFR-Tyrosinkinase-Hemmer
Gefitinib	MCE		EGFR-Tyrosinkinase-Hemmer
Linifanib	MCE		Multi-Target-Inhibitor der VEGFR- und PDGFR-Familie
Masitinib	MCE		Inhibitor von c-Kit
Nr. ML141	Selleck		Nicht-kompetitiver Inhibitor der Cdc42-GTPase
OSI-930	MCE		Multi-Target-Inhibitor von Kit, KDR und CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selektiver CDK4- und CDK6-Inhibitor
SB 202190	MCE		Selektiver p38-MAP-Kinase-Inhibitor
Sepantroniumbromid (YM-155)	MCE		Survivin-Hemmer
TCS 359	Selleck		Potenter FLT3-Hemmer
UMI-77	MCE		Selektiver Mcl-1-Inhibitor
4-Hydroxytamoxifen (Afimoxifen)	Selleck		Selektiver Östrogenrezeptor (ER)-Modulator