SEC-basierte Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Mikroglia: Eine Technik zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Mikroglia-konditionierten Kulturmedien

Zusammenfassung

Quelle: Lemaire, Q. et al. Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln aus Immunzellen und Untersuchung des funktionellen Einflusses auf die Zellumgebung. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video beschreibt eine Methode, die auf Größenausschlusschromatographie (SEC) basiert, um extrazelluläre Vesikel oder EVs zu isolieren, die aus den Immunzellen des Gehirns – den Mikroglia – stammen. Die EVs fungieren als molekulare Fracht, um Mediatoren zu liefern, die eine Immunantwort regulieren. Daher können die isolierten EVs als in vitro Modell verwendet werden, um die Mikroglia-Neuronen-Wechselwirkung während einer neuronalen Immunantwort zu untersuchen.

Protokoll

>1. Primärkultur von Mikroglia/Makrophagen

1. Primärkultur von Mikroglia
   1. Kulturieren Sie kommerzielle primäre Mikroglia von Ratten (2 x 10⁶ Zellen) (siehe Materialtabelle) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % exosomenfreiem Serum, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 9,0 g/l Glukose bei 37 °C und 5 % CO₂.
   2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 48-stündigen Kultur und fahren Sie mit der Isolierung der EVs fort.
2. Primärkultur von Makrophagen
   1. Kultivieren Sie handelsübliche Primärmakrophagen der Ratte (1 x 10,⁶ Zellen) in dem vom Hersteller bereitgestellten Medium (siehe Materialtabelle) bei 37 °C und 5 % CO₂ mit exosomenfreiem Serum.
   2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 24-stündigen Kultur und fahren Sie mit der Isolierung der EVs fort.

>2. Isolierung von Elektrofahrzeugen

1. Vorisolierung von Elektrofahrzeugen aus konditioniertem Medium
   1. Das konditionierte Kulturmedium aus Mikroglia- oder Makrophagenkulturen (Schritte 1.1.2 oder 1.2.2) wird in ein konisches Röhrchen überführt.
   2. Zentrifugieren Sie bei 1.200 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT), um die Zellen zu pelletieren.
   3. Den Überstand in ein neues konisches Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie bei 1.200 x g für 20 min bei RT, um apoptotische Körper zu eliminieren.
   4. Übertragen Sie den Überstand in ein 10,4-ml-Polycarbonat-Röhrchen und übertragen Sie das Röhrchen in einen 70,1-Ti-Rotor. Ultrazentrifugieren Sie bei 100.000 x g für 90 min bei 4 °C, um die Elektrofahrzeuge zu pelletieren.
   5. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit EVs in 200 μl 0,20 μm gefilterter Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS).
2. Isolierung von Elektrofahrzeugen
   1. Vorbereitung der hausgemachten Größenausschluss-Chromatographiesäule (SEC)
      1. Eine Glaschromatographiesäule (Länge: 26 cm; Durchmesser: 0,6 cm) entleeren (siehe Materialtabelle), waschen und sterilisieren.
      2. Platzieren Sie einen 60-μm-Filter am unteren Rand der Säule.
      3. Stapeln Sie die Säule mit einer vernetzten Agarosegel-Filtrationsbasismatrix, um eine stationäre Phase mit einem Durchmesser von 0,6 cm und einer Höhe von 20 cm zu erzeugen.
      4. Spülen Sie die Phase mit 50 mL 0,20 μm filtriertem PBS. Bei 4 °C lagern, um bei Bedarf später verwendet zu werden.
   2. Legen Sie das resuspendierte EV-Pellet auf die stationäre Phase der SEC-Säule.
   3. Sammeln Sie 20 sequenzielle Fraktionen von 250 μl und fügen Sie weiterhin 0,20 μm gefiltertes PBS auf die Oberseite der stationären Phase hinzu, um ein Austrocknen der Säule zu verhindern. Lagern Sie die Fraktionen bei Bedarf bei -20 °C.
      Anmerkung: Eine längere Lagerung als eine Woche kann bei -80 °C durchgeführt werden, um die EV-Integrität für die molekulare Analyse zu erhalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nährmedium für Rattenmakrophagen und Mikroglia	Zell-Anwendungen	R620K-100	Zellherkunft: Normale, gesunde Ratte Knochenmark
Primäre Mikroglia der Ratte	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Gesundheitswesen	17014001
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Nr. A95765
Ultrazentrifuge Rotor 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
Traubenzucker	Sigma-Aldrich	Nr. G8769
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Invitrogen	14190094	Kein Kalzium, kein Magnesium
Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat	Beckman Coulter	355651
Penicillin-Streptomycin	Gibco	Nr. 15140-122
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	Exosom-depletiertes FBS
DMEM Gibco 41966029
Zentrifuge	Eppendorf	5804000010
CO2-Inkubator	ThermoFisher
pluriStrainer M/ 60 μm	pluriSelect	Tel.: 43-50060
MonoP FPLC-Säule	GE Gesundheitswesen		Nicht mehr lieferbar