SDS-PAGE-basierte Extraktion von extrazellulären Vesikel-assoziierten Proteinen: Ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen aus EVs und deren Vorbereitung für den In-Gel-Verdau

Zusammenfassung

Quelle: Lemaire, Q. et al. Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln aus Immunzellen und Untersuchung des funktionellen Einflusses auf die Zellumgebung. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir die SDS-PAGE In-Gel-Verdauungsmethode für die Proteinextraktion aus extrazellulären Vesikeln oder EVs. Nach der Isolierung können die erhaltenen Proteinfragmente für die proteomische Analyse verwendet werden.

Protokoll

>1. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen

1. Western-Blot-Analyse
   1. Protein-Extraktion
      1. Isolieren Sie die EVs mit Hilfe der Größenausschlusschromatographiesäule (SEC) und quantifizieren Sie sie mit der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA).
      2. Mischen Sie 50 μl RIPA-Puffer (150 mM Natriumchlorid [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure [EGTA], 2 mM Ethylendiamin-tetraessigsäure [EDTA], 100 mM Natriumfluorid [NaF], 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 % Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF], 1x Proteaseinhibitor) mit der EV-Probe (25 μl resultierend aus der EV-Konzentration auf dem Filter) für 5 min auf Eis bis Extraktion von Proteinen.
      3. Beschallung für 5 s (Amplitude: 500 W; Frequenz: 20 kHz), 3 mal auf Eis.
      4. Entfernen Sie vesikuläre Ablagerungen durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C.
      5. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford-Protein-Assay-Methode.
   2. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blotting
      1. Mischen Sie Proteinextrakte (30 μg) mit 5c Laemmli Probenpuffer (v/v).
      2. Laden Sie den Proteinmix auf ein 12%iges Polyacrylamid-Gel.
      3. Migrieren Sie die Proteine im Gel mit TGS-Puffer (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycin und 0,1 % SDS) bei 70 V für 15 min und 120 V für 45 min.
      4. Übertragen Sie die Proteine für 30 min auf eine Nitrozellulosemembran mit halbtrockenem System bei 230 V.
      5. Sättigen Sie die Membran 1 h lang bei RT mit Blockierungspuffer (0,05 % Tween 20 w/v, 5 % Milchpulver w/v in 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Die Membran wird über Nacht bei 4 °C mit einem monoklonalen Antikörper gegen das humane Hitzeschockprotein 90 (HSP90) der Maus inkubiert, der in einem Blockierungspuffer (1:100) verdünnt ist.
      7. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) für 15 min.
      8. Inkubieren Sie die Membran 1 h lang bei RT mit Ziegenmeerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierungspuffer (1:10.000).
         HINWEIS: Eine Negativkontrolle wird nur mit Sekundärantikörpern durchgeführt.
      9. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 1.1.2.7).
      10. Enthüllen Sie die Membran mit einem Western Blotting Substrat-Kit mit verbesserter Chemilumineszenz (ECL) (siehe Materialtabelle).

>2. Proteomische Analyse

1. Proteinextraktion und In-Gel-Verdauung
   1. Isolieren Sie die EVs mit Hilfe der Größenausschlusschromatographiesäule (SEC) und quantifizieren Sie sie mit der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Wiederholen Sie Schritt 1.1.1 für die Extraktion von EV-Proteinen.
   2. Führen Sie eine Proteinmigration im Stapelgel eines 12%igen Polyacrylamid-Gels durch.
   3. Fixieren Sie die Proteine im Gel mit Coomassie blue für 20 min bei RT.
   4. Schneiden Sie jedes farbige Gelstück aus und schneiden Sie es in kleine Stücke von 1 mm³.
   5. Waschen Sie die Gelstücke nacheinander mit 300 μl jeder Lösung: Reinstwasser für 15 min, 100 % Acetonitril (ACN) für 15 min, 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH₄HCO₃) für 15 min, ACN: 100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) für 15 min und 100 % ACN für 5 min unter ständigem Rühren.
   6. Trocknen Sie die Gelstücke vollständig mit einem Vakuumkonzentrator.
   7. Führen Sie eine Proteinreduktion mit 100 μl 100 mM NH₄HCO₃ mit 10 mM Dithiothreitol für 1 h bei 56 °C durch.
   8. Die Proteinalkylierung mit 100 μl 100 mM NH₄HCO₃ mit 50 mM Jodacetamid für 45 min im Dunkeln bei RT durchführen.
   9. Waschen Sie die Gelstücke nacheinander mit 300 μL jeder Lösung: 100 mM NH₄HCO₃ für 15 min, ACN: 20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) für 15 min und 100% ACN für 5 min unter ständigem Rühren.
   10. Trocknen Sie die Gelstücke mit einem Vakuumkonzentrator vollständig ab.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetonitril	Fisher Chemikalien	Nr. A955-1
Ammoniumbikarbonat	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 α/β Antikörper (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	SC-13119
Bio-Rad Protein Assay Farbstoff-Reagenzkonzentrat (Bradford)	Bio-Rad	5000006
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 43819
Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′- Tetraessigsäure	Sigma-Aldrich	03777-10G
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma-Aldrich	ED-100G
Fisherbrand Q500 Ultraschallgerät mit Sonde	Fisherbrand	12893543
Idoacetamid	Sigma-Aldrich	Nr. I1149
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Expedeon	ISB1L
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Nonidet P-40	Fluka	Artikel-Nr.: 56741
Peroxidase AffiniPure Ziege AntiMaus IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 115-035-003
Phalloidin-Tetramethylrhodamin-Konjugat	Santa-cruz	Artikel-Nr.: SC-362065
Protease-Hemmer	Sigma-Aldrich	Nr. S8830-20TAB
Natriumchlorid	Scharlau	Nr. SO0227
Natriumdodecylsulfat	Sigma-Aldrich	Nr. L3771
Natriumfluorid	Sigma-Aldrich	Nr. S7920-100G
Natriumpyrophosphat	Sigma-Aldrich	Nr. S6422-100G
SpeedVac Vakuum-Konzentrator	ThermoFisher
Trans-Blot SD Semi-Dry Transferzelle	Bio-Rad	1703940