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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Intravitale Bildgebung
HINWEIS: Das Zeitintervall zwischen der Tumorzellinjektion und der ersten intravitalen Bildgebungssitzung hängt von der Art der verwendeten Tumorzelllinie ab. Für die in diesem Protokoll gezeigten Experimente wurden 1x 105 GL261 Zellen injiziert und 10 Tage später abgebildet.
- Vorbereitung der Bildgebung
- Sedieren Sie die Maus mit einer Isofluran-Inhalationsanästhesie durch eine Gesichtsmaske (1,5%–2% Isofluran/O2-Gemisch).
- Injizieren Sie der Maus subkutan 100 μl Kochsalzpuffer, um eine Austrocknung zu verhindern.
Anmerkung: Für die Langzeitbildgebung kann die Maus über eine subkutane Infusionspumpe hydratisiert werden.
- Legen Sie die Maus mit der bedruckten Seite nach oben in eine Imaging-Box. Verwenden Sie eine Metallplatte mit einem Loch von 1 mm Durchmesser und kleinen Magneten, die um die Blende herum eingebettet sind, um das CIW an der Bildbox zu befestigen. Führen Sie Isofluran durch eine Gesichtsmaske ein und lüften Sie durch einen Auslass auf der anderen Seite der Schachtel (0,8 % – 1,5 % Isofluran/O2 -Gemisch). Verwenden Sie optional Klebeband, um das Gehäuse der Maus zu fixieren.
Anmerkung: Fluoreszenzmarkiertes Dextran zur Visualisierung von Blutgefäßen oder andere Farbstoffe können an dieser Stelle intravenös injiziert werden.
- Optional können Sie ein Pulsoximeter und eine Heizsonde verwenden, um die Vitalwerte des Mous zu überwachen.
Anmerkung: In diesem Experiment war es nicht notwendig, ein Pulsoximeter und eine Heizsonde zu verwenden, da die Maus während der gesamten Bildgebungszeit (2–3 h) stabil war. Bei längeren Bildgebungszeiten kann jedoch eine gründlichere Überwachung erforderlich sein.
- Stellen Sie das Wasserobjektiv 25x (z.B. HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) auf die niedrigste Z-Position und fügen Sie einen großen Tropfen Wasser hinzu.
Anmerkung: Die Verwendung eines Wasserimmersions-Mikrodispensers wird für Langzeitexperimente dringend empfohlen, da er es den Wissenschaftlern ermöglicht, während des Experiments Wasser hinzuzufügen. Alternativ kann auch ein trockenes Objektiv verwendet werden.
- Übertragen Sie die Imaging-Box auf das Mikroskop, das mit einer dunklen Klimakammer mit 37 °C ausgestattet ist. Bringen Sie das Objektiv auf das CIW-Deckglas, bis der Wassertropfen es berührt.
- Beobachten Sie mit dem Epifluoreszenzmodus den Tumor durch das Okular und bringen Sie die Zellen in den Fokus.
2. Zeitraffer-Bilderfassung
- Wählen Sie mehrere Positionen aus, die Sie abbilden möchten, und zeichnen Sie deren Koordinaten in der Software auf. Stellen Sie sicher, dass es sich bei den ausgewählten Positionen um repräsentative Positionen von verschiedenen Stellen des Tumors handelt (jeder Tumor kann unterschiedlich sein, aber um Konsistenz zu gewährleisten, wählen Sie bei allen Mäusen die gleiche Anzahl von Positionen aus, die für den Tumorkern und die Ränder zentral für den Tumorkern und für die Ränder sind)
Anmerkung: Es kann ein Fliesenscan eines Teils des Tumors oder des gesamten sichtbaren Tumors durchgeführt werden; Wenn der Tumor jedoch groß ist, erhöht diese Methode den Zeitraffer zwischen den Bildern. Wenn sich die Tumorzellen schnell bewegen, kann es außerdem schwierig sein, dieselben Zellen über die Zeit zu verfolgen.
- Wechseln Sie in den Multiphotonenmodus und stimmen Sie den Laser auf die richtige Wellenlänge ab. Beachten Sie, dass zur Vermeidung von Lichtschäden höhere Wellenlängen gewünscht sind.
Anmerkung: Für die Dendra2-Bildgebung wurde eine Wellenlänge von 960 nm verwendet. Mit dem in diesen Experimenten verwendeten Objektiv war ein Zoom von 1,3 ausreichend, um eine gute Auflösung der Tumorkerne zu erhalten und einen repräsentativen Bereich des Tumors zu scannen.
- Gehen Sie in den Live-Modus und definieren Sie für jede Position einen Z-Stack, um das maximale Volumen der Tumorzellen zu erfassen, ohne die Auflösung der Tumorzellen zu beeinträchtigen. Definieren Sie die Schrittweite zwischen den Bildern als 3 μm.
- Verwenden Sie den bidirektionalen Modus, um die Scangeschwindigkeit zu erhöhen. Die Bildauflösung sollte mindestens 512 x 512 Pixel betragen.
- Nehmen Sie Bilder des Tumorvolumens an verschiedenen Positionen alle 20 Minuten für 2 Stunden auf. Geben Sie vor jeder Bildaufnahme Wasser in das Objektiv.
Anmerkung: Zeitrafferbilder können automatisch aufgenommen werden, indem der richtige Zeitraffer in der Software eingestellt wird. Die Maus kann sich jedoch bewegen, und die Position oder der Z-Stapel kann sich im Laufe der Zeit verschieben, was zu Datenverlust führt. Daher wird empfohlen, den Zeitraffer manuell durchzuführen und zwischen den Aufnahmen auf xyz-Verschiebungen zu prüfen und einzustellen.
- In diesem Schritt können Sie optional den Dendra2-Fluoreszenzmarker fotoschalten.
Anmerkung: Im Gegensatz zur Zeitraffer-Bildgebung (die es ermöglicht, die Eigenschaften einzelner Tumorzellen und deren Veränderung im Laufe der Zeit zu untersuchen) ermöglicht dies die Untersuchung des Bereichs der Infiltration von Tumorzellen im Gehirn über mehrere Tage.