>1. In-vitro-Assay zur Anziehungskraft von Makrophagen
- Aufbereitung von konditionierten Medien
- Erwärmen Sie das Tumorzellerhaltungsmedium bei einem 37 °C warmen Wasserbad für 20 min.
- Besprühen Sie die Oberfläche der Gewebekulturhaube mit 70 % Ethanol und wischen Sie 70 % Ethanol mit Küchenpapier auf der Oberfläche ab. Nehmen Sie die Lösung zur Zellablösung aus dem Kühlschrank. Besprühen Sie die Flaschen des Mediums und der Zellablösungslösung mit 70 % Ethanol, wischen Sie 70 % Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
- Nehmen Sie die 6-Well-Platten aus dem Inkubator. Pipettieren Sie das konditionierte Medium vorsichtig in sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie die Röhren auf Eis. Pipettieren Sie das Medium "nur Medium" gut in ein separates steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Überprüfen Sie vor diesem Schritt unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen anlagern. Wenn nicht, kann man beschichtete Platten verwenden, um eine bessere Befestigung zu ermöglichen, oder die schwimmenden Zellen in den Zählschritt einbeziehen.
- Geben Sie 0,5 ml Zellablösungslösung in jede Vertiefung der 6-Well-Platte. Prüfen Sie, ob sich die Tumorzellen im Minutentakt aufrunden. Sobald sich die Tumorzellen aufgerundet haben, klopfen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte, um den Zellen zu helfen, sich zu lösen.
- Pipettieren Sie 2,5 ml Tumorzellerhaltungsmedium in die Vertiefung, pipettieren Sie 3 Mal auf und ab, um die Zellen zu mischen, und geben Sie sie in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Nehmen Sie 10 μl der Zellen und mischen Sie sie mit 10 μl Trypanblau-Lösung. Pipettieren Sie 10 μl der Mischung in den Zählobjektträger und quantifizieren Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatischen Zellzähler.
- Passen Sie das Volumen des konditionierten Mediums entsprechend der Zellzahl mit dem serumfreien Stammzellmedium an (37 °C Inkubation über Nacht). Wenn z. B. Vertiefung A 3x so viele lebende Zellen hat wie die Vertiefung mit der geringsten Anzahl von Zellen, verdünnen Sie das konditionierte Medium 1:3. Dieser Schritt wird verwendet, um die Differenz zu kontrollieren, die durch die Zellproliferationsrate verursacht wird.
Anmerkung: Der Grund für die Verwendung von serumfreiem Stammzellmedium mit 37 °C Inkubation über Nacht besteht darin, die mögliche Veränderung des Mediums bei längerer Exposition von 37 °C zu kontrollieren.
- Filtern Sie die konditionierten Medien durch 0,45 μm Filter. Legen Sie das konditionierte Medium auf Eis.
HINWEIS: Dieser Schritt entfernt Zellen und Zelltrümmer in den konditionierten Medien.
>2. Vorbereitung von MV-4-11 Zellen
- Erwärmen Sie das IMDM-Medium (ohne FBS) bei einem 37 °C warmen Wasserbad für 20 min.
- Besprühen Sie die Oberfläche der Gewebekulturhaube mit 70 % Ethanol und wischen Sie 70 % Ethanol mit Küchenpapier auf der Oberfläche ab. Besprühen Sie die mittlere Flasche mit 70% Ethanol, wischen Sie 70% Ethanol auf der Oberfläche mit Papiertüchern ab und bringen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
- Nehmen Sie den Kolben mit den MV-4-11-Zellen in die Gewebekulturhaube. Pipettieren Sie 10 ml Zellen in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Nehmen Sie 10 μl Zellen und mischen Sie sie mit 10 μl Trypanblau-Lösung. Pipettieren Sie 10 μl der Mischung in den Zählobjektträger und quantifizieren Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatischen Zellzähler. Die Zellen werden bei 200 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 mL PBS und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen in IMDM-Medium (ohne FBS) für eine endgültige Zelldichte von 1x106 Zellen/ml.
HINWEIS: Die Zellzahl der hier verwendeten Makrophagen kann angepasst werden.
>3. Transwell-Assay
HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Schritt ein Zellmigrations-Assay-Kit oder kaufen Sie die Reagenzien und setzen Sie sie separat ein. Für MV-4-11-Zellen wählen Sie Transwell-Einsätze mit einer Porengröße von 5 μm. Um die Migration von Makrophagen zu erkennen, quantifizieren Sie direkt die Anzahl der Makrophagen in der unteren Kammer oder verwenden Sie kolorimetrische/fluorimetrische Methoden. Hier demonstrieren wir den Assay mit der kolorimetrischen Methode.
- Bringen Sie die 24-Well-Platte, den Einsatz und die Reagenzien auf Raumtemperatur.
- Geben Sie 250 μl der oben vorbereiteten MV-4-11-Zellen in jeden Einsatz.
Geben - Sie 400 μl konditioniertes Medium/Medium (bei Inkubation über Nacht bei 37 °C, diese Proben dienen als Negativkontrolle) in die unteren Kammern der 24-Well-Platte. Verwenden Sie für jede Tumorlinie oder -kontrolle dreifache Proben. Vermeiden Sie Blasen zwischen dem Einsatz und dem konditionierten Medium. Blasen verhindern, dass Makrophagen in die Vertiefungen am Boden wandern.
- Inkubieren Sie die Platten in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 für 4 h.
HINWEIS: Die Inkubationszeit kann angepasst werden. Zellen, die in die unteren Kammern wandern, sind unter dem Mikroskop zu sehen.
- Klopfen Sie den Einsatz vorsichtig an die Innenwand derselben Vertiefung und entsorgen Sie den Einsatz. Da MV-4-11-Zellen in Suspension wachsen, ist hier keine Zellablösungslösung oder Trypsinbehandlung erforderlich.
- Pipettieren Sie die Zellen in den Vertiefungen vorsichtig 3 Mal auf und ab, um sie zu mischen. Übertragen Sie 225 μl Zellsuspension auf eine schwarzwandige 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist.
- Verdünnen Sie den CyQuant Farbstoff 1:75 mit 4x Lysepuffer. Kurz vortexen und die Lösung herunterschleudern. Geben Sie 75 μl Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Lesen Sie die Fluoreszenz mit dem 480/520 nm Filterset mit einem Fluoreszenzplatten-Reader.
- Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Leerprobe subtrahieren und auf die Kontrolltumorzelllinie normalisieren.
