Extraktion extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus ganzen Gewebeproben mittels Differenzialzentrifugation

Zusammenfassung

Quelle: Hurwitz, S. N. et al. Extraktion von extrazellulären Vesikeln aus ganzem Gewebe. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus frischem oder gefrorenem Gewebe. Die isolierten extrazellulären Vesikel können für weitere Analysen verwendet werden, um ihre bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Krankheit aufzudecken.

Protokoll

>1. Gewebedissoziation und differentielle Zentrifugation

1. Bereiten Sie 10 ml Dissoziationspuffer (10 mg Papain; 5,5 mM L-Cystein; 67 μM 2-Mercaptoethanol; 1,1 mM EDTA) in Hibernate-E-Medium für ca. 0,4–1,0 g Gewebe vor.
   HINWEIS: Alle Lösungen, die für die Anreicherung und Reinigung von Elektrofahrzeugen verwendet werden, sollten in hochreinem gefiltertem Wasser verdünnt werden.
2. Geben Sie ganzes, frisches oder gefrorenes Gewebe in einen Dissoziationspuffer in einem konischen 50-ml-Röhrchen und inkubieren Sie es 20 Minuten lang in einem warmen Wasserbad bei 37 °C. Das Gewebe kann bei Bedarf vor der Inkubation in kleinere Fragmente geschnitten werden.
3. Nach der Inkubation Protease- und Phosphatasehemmer für eine abschließende 1-fache Konzentration in den Dissoziationspuffer, der das Gewebe enthält, geben.
4. Gießen Sie die Lösung, die das Gewebe enthält, in einen locker sitzenden Dounce-Homogenisator und dissoziieren Sie das Gewebe vorsichtig mit etwa 30 langsamen Hüben pro Probe. Die Anzahl der Hübe kann je nach Gewebekonsistenz angepasst werden.
5. Dissoziiertes Gewebe in Puffer in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführen und 5 Minuten lang bei 4 °C bei 500 x g zentrifugieren, um die Zellen und die verbleibenden faserigen oder kohäsiven Gewebefragmente zu pelletieren.
6. Den Überstand in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen umfüllen und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 2.000 x g zentrifugieren, um große zelluläre Trümmer zu pelletieren und zu entsorgen.
7. Den Überstand erneut in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen überführen und bei 10.000 x g für 40 min bei 4 °C zentrifugieren, um unerwünschte größere Vesikel oder kleine apoptotische Körper zu pelletieren.
   HINWEIS: Dieses Pellet kann auf Wunsch für zusätzliche Untersuchungen größerer Vesikel aufbewahrt werden.
8. Der Überstand wird durch einen 0,45-μm-Filter in ein sauberes 12-ml-Ultrazentrifugationsröhrchen umgefüllt.
   Anmerkung: Dicht fibrotische Gewebeproben lassen sich möglicherweise nicht leicht filtrieren. Diese Proben können durch ein 40-μm-Zellsieb filtriert und dann durch seriell kleinere Nadeln (18 G, 20 G, 22 G) geleitet werden, bevor sie durch den 0,45-μm-Filter filtriert werden.
9. Ultrazentrifugieren Sie die Probe bei 100.000 x g für 2 Stunden bei 4 °C, um kleine Elektrofahrzeuge zu pelletieren.
10. Dekantieren Sie den Überstand und lassen Sie die Ultrazentrifugationsröhrchen 5–10 Minuten lang umgedreht, wobei Sie häufig klopfen, um Flüssigkeitsreste an den Seiten der Röhrchen zu entfernen. Restflüssigkeit kann auch mit einer Vakuum-Ansaugpipette abgesaugt werden.
11. Resuspendieren Sie das EV-Pellet in 1,5 mL 0,25 M Saccharosepuffer (10 mM Tris, pH 7,4). In diesem Schritt ist es wichtig, dass das Pellet vollständig resuspension wird. Decken Sie dazu die Röhrchen mit Parafilm ab, bevor Sie EVs in Lösung vortexen. Schütteln Sie die Ultrazentrifugenröhrchen 15-20 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie eine abschließende Vortex-Mischung durchführen.
12. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz mit einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 1.000 x g, um die flüssige Suspension am Boden des Röhrchens zurückzugewinnen.
13. Fahren Sie mit den folgenden Schritten zur Gradientenreinigung fort oder lagern Sie die EV-Suspension bei Bedarf über Nacht bei 4 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,45 μm Filter	VWR	Tel.: 28145-505
12 mL Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	331372
5,5 mL Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	344057
HALT-Phosphatase-Hemmer (100-fache Lösung)	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 78420
HALT-Proteasehemmer (100x Lösung)	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 78438
Ruhezustand E mittel	ThermoFisher Scientific	A1247601
MLS-50 Ausschwingrotor	Beckman Coulter	Artikel-Nr.: 367280
Optima MAX-XP Tisch-Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	393315