Reinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Aufreinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation

Zusammenfassung

Quelle: Urwitz, S. N. et al. Extraktion extrazellulärer Vesikel aus ganzem Gewebe. J. Vis. (2019)

Dieses Video demonstriert die auf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende Aufreinigungsmethode zur Isolierung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel, die für Charakterisierungsstudien geeignet sind.

Protokoll

>1. Reinigung des Dichtegradienten

1. Fügen Sie 1,5 ml 60 % Iodixanol (Stammlösung in Wasser) zu dem 1,5 ml Saccharose/Tris-Puffer hinzu, der EVs enthält, um eine endgültige Lösung mit 30 % Iodixanol herzustellen. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Lösung gründlich zu mischen.
   Anmerkung: Seien Sie vorsichtig, um keine Lösung in der Pipettenspitze zu verlieren, da die hohe Iodixanolkonzentration ziemlich viskos ist.
2. Übertragen Sie die 30%ige Iodixanol-Pufferlösung, die EVs enthält, auf den Boden eines 5,5-ml-Ultrazentrifugationsröhrchens.
3. Bereiten Sie mindestens 1,5 ml 20%ige und 10%ige Iodixanollösungen pro Probe in Reinstwasser aus der 60%igen Iodixanol-Stammlösung vor.
4. Messen Sie 1,3 ml 20% Iodixanol und tragen Sie es vorsichtig mit einer Spritze und einer 18-G-Nadel auf die untere Gradientenschicht auf. Um eine Vermischung der Schichten an der Dichtegrenzfläche zu vermeiden, halten Sie die Fase der Nadel in Kontakt mit der Innenseite des Ultrazentrifugationsröhrchens direkt über dem Meniskus und fügen Sie die Lösung tropfenweise hinzu.
5. Schicht 1,2 ml 10%ige Iodixanollösung auf die 20%ige Iodixanolschicht mit der gleichen Technik wie oben.
6. Die Ultrazentrifugationsröhrchen vorsichtig ausbalancieren und in Rotorbecher laden und in einem Ausschwingrotor bei 268.000 x g für 50 min bei 4 °C zentrifugieren. Die Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeiten der Zentrifuge auf die minimal zulässigen Raten einstellen, um eine Störung der Dichteschichten zu vermeiden.
7. Markieren Sie zehn 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe so, dass sie den Fraktionen 1 bis 10 der Dichtegradienten entsprechen. Fraktion 1 wird als oberste Fraktion bezeichnet, die zuerst entfernt wird, während Fraktion 10 die unterste Fraktion ist, die zuletzt entfernt wird.
8. Sobald die Gradienten-Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus den Rotorbechern und legen Sie sie in eine stabile Halterung. Ein sichtbares Band von Vesikeln ist oft in dem interessierenden Bruchteil zu sehen. Pipettieren Sie zehn serielle Fraktionen von 490 μl vom oberen Rand des Gradienten in die entsprechenden Röhrchen. Am Boden des Röhrchens verbleibt eine kleine Menge Flüssigkeit, die wahrscheinlich kontaminierende Proteine enthält. Diese Probe kann verworfen oder als Fraktion 11 zurückgehalten werden, falls gewünscht.
9. Messen Sie die Brechungsindizes von Fraktionen mit einem Refraktometer. Dies kann auch mit einem parallel laufenden Kontrollgradienten durchgeführt werden, wenn eine Probenkonservierung erforderlich ist. Pipettieren Sie 20–30 μl jeder iodixanolhaltigen Fraktion auf die Refraktometeroberfläche und schätzen Sie die Dichte, indem Sie die Brechungsindizes mit bekannten Iodixanoldichten vergleichen.
   Anmerkung: Fraktionen können bei Bedarf über Nacht in der iodixanolhaltigen Lösung gelagert werden, bevor sie mit dem nächsten Ultrazentrifugationswaschschritt fortfahren.
10. Übertragen Sie jede Fraktion in ein sauberes 12-ml-Ultrazentrifugationsröhrchen. Geben Sie 5 mL 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) in das Röhrchen und mischen Sie es durch langsames Auf- und Abpipettieren.
    HINWEIS: PBS, das den Proben zugesetzt wird, sollte partikelfrei sein, was durch Filtrieren von sterilem PBS durch einen 0,22-μm-Filter und Lagerung bei Raumtemperatur gewährleistet wird, um Salzfällungen zu vermeiden.
11. Geben Sie weitere 6 mL 1x PBS nach oben und mischen Sie erneut vorsichtig.
12. Ultrazentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C, um kleine Vesikel wieder zu pelletieren. Der Überstand wird dekantiert und die Röhrchen trocken geklopft, bevor die Vesikel für die Proteinanalyse oder die EVs für die morphologische Analyse resuspendiert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,45 μm Filter	VWR	Tel.: 28145-505
12 mL Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	331372
5,5 mL Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	344057
Rotor FA-45-6-30	Eppendorf	5820715006
MLS-50 Ausschwingrotor	Beckman Coulter	Artikel-Nr.: 367280
Optima MAX-XP Tisch-Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	393315
Optima XE-100 Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Nr. A94516
Optiprep	Sigma	Nr. D1556	60% Iodoxanol in steriler Wasserlösung
Refracto 30PX (Refraktometer)	Mettler Toledo	51324650
S-4-104 Rotor	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti Schwingschaufel Rotor	Beckman Coulter	Artikel-Nr.: 333790
Tischzentrifuge 5804R	Eppendorf	22623508