Methodenartikel

Generierung von induzierten neuralen Stammzellen (iNSCs) aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs): Ein auf dem Sendai-Virus basierendes Verfahren zur Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Zheng, W. et al. Generierung von induzierten neuralen Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorläufern für Transplantationsstudien.J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs) in induzierte neurale Stammzellen (iNSCs) unter Verwendung des Sendai-Virus. Das Sendai-Virus ist ein nicht-integrierendes Virus, das ein effizientes und sicheres Vehikel für die Reprogrammierung von Zellen bietet.

Protokoll

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>1. Reprogrammierung von PBMNCs zu iNSCs durch SeV-Infektion

  1. Vorbereitung der Lösung und des Nährmediums
    1. Bereiten Sie eine Poly-D-Lysin (PDL)-Stammlösung her, indem Sie 100 mg PDL mit 100 ml H2O in einer Konzentration von 1 mg/ml auflösen. Bei -20 °C in 1 mL Aliquoten lagern.
    2. Bereiten Sie eine Insulin-Stammlösung vor, indem Sie 100 mg Insulin in 20 ml 0,01 N HCl auf eine Konzentration von 5 mg/ml auflösen. Bei -20 °C in 1 mL Aliquoten lagern.
    3. Um 200 mL iNSC-Basalmedium herzustellen, kombinieren Sie 96 mL DMEM-F12 und 96 mL basisches Medium (Materialtabelle) mit 2 mL 100x Glutamin-Stammlösung, 2 mL nicht-essentieller Aminosäure (NEAA), 2 mL N2-Supplement und 2 mL B27-Supplement. Vor der Anwendung 10 ng/ml rekombinanten humanen Leukämie-Hemmfaktor, 3 μM CHIR99021 und 2 μM SB431542 zugeben. Filtern Sie das Medium und lagern Sie es bei 4 °C.
      Anmerkung: Verwenden Sie das Medium innerhalb von 2 Wochen. Unmittelbar vor der Anwendung rekombinanten humanen Leukämie-Hemmfaktor, CHIR99021 und SB431542 zugeben.
  2. Reprogrammierung von PBMNCs zu iNSCs durch SeV-Infektion
      Vor
    1. der Verwendung eine saubere Bank mit UV-Strahlung sterilisieren. Sterilisieren Sie alle Oberflächen und Geräte mit 75% Alkohol. Sterilisieren Sie alle Spitzen im Autoklaven.
    2. Am Tag 0 werden die Zellen in MNC-Medium gesammelt und in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml vorgewärmtem MNC-Medium.
    3. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau. Resuspendieren Sie die Zellen mit vorgewärmtem (37 °C) MNC-Medium auf eine Konzentration von 2 x 105 Zellen pro Well in 24-Well-Platten.
    4. Nachdem Sie die SeV-Röhrchen aus der -80 °C-Lagerung genommen haben, tauen Sie die Röhrchen mit SeV 5–10 s lang im 37 °C-Wasserbad auf und lassen Sie sie dann bei RT auftauen. Nach dem Auftauen sofort auf Eis legen.
    5. Fügen Sie das SeV-kodierende humane Klf4, Oct3/4, SOX2 und c-MyC bei einer Multiplizitätsinfektion (MOI) von 10 in die Vertiefungen ein. Zentrifugieren Sie Zellen mit Platten von 1.000 x g für 30 Minuten, um die Anheftung der Zellen zu erleichtern. Lassen Sie die Zellen und den Überstand in den Platten. Legen Sie die Platten bei 37 °C, 5 % CO2,
      in den Inkubator. ACHTUNG: Alle Eingriffe mit SeV müssen in einer Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, und alle Spitzen und Tuben sollten vor der Entsorgung mit Ethanol oder Bleiche behandelt werden.
    6. Übertragen Sie das Medium und die Zellen an Tag 1 in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Mulde mit 1 ml MNC-Medium aus. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 500 μl frischem, vorgewärmtem MNC-Medium in 24-Well-Platten.
      Anmerkung: Verwenden Sie eine 24-Well-Platte mit geringer Anhaftung, um das Anhaften von Zellen zu verhindern, bevor Sie PDL/Laminin aufpolieren.
    7. Verdünnen Sie an Tag 2 1 ml 1 mg/ml PDL mit 19 ml D-PBS auf eine Konzentration von 50 μg/ml. Beschichten Sie 6-Well-Platten mit 50 μg/mL PDL für mindestens 2 h bei RT.
    8. Verdünnen Sie 200 μl 0,5 mg/ml Laminin mit 20 mL D-PBS auf eine Konzentration von 5 μg/ml. Aspirieren Sie PDL in den 6-Well-Platten und trocknen Sie es auf der vertikalen Reinigungsbank.
    9. 6-Well-Platten mit 5 μg/ml Laminin beschichten und 4–6 h bei 37 °C inkubieren. Vor Gebrauch mit D-PBS waschen.
    10. An Tag 3 werden die in Schritt 1.2.6 gewonnenen transduzierten Zellen in iNSC-Medium auf PDL/Laminin-beschichteten 6-Well-Platten plattiert.
      Anmerkung: Bewegen Sie die Platten bei Bedarf vorsichtig, nachdem die Zellen auf PDL/Laminin-beschichtete Platten gelegt wurden, und versuchen Sie, die Anhaftung der Zellen nicht zu stören.
    11. Geben Sie an Tag 5 vorsichtig 1 ml vorgewärmtes (37 °C) iNSC-Medium in jede Vertiefung in 6-Well-Platten.
      Anmerkung: Es wird erwartet, dass die Zellen einen drastischen Tod erleiden werden (>60%).
    12. Geben Sie an Tag 7 vorsichtig 1 ml vorgewärmtes (37 °C) iNSC-Medium in jede Vertiefung in 6-Well-Platten.
    13. Ersetzen Sie von Tag 9 bis Tag 28 täglich verbrauchtes Medium durch frisches, vorgewärmtes (37 °C) iNSC-Medium. Überwachen Sie das Auftreten von iNSC-Kolonien. Auswählen und Übertragen von iNSC-Klonen für die Erweiterung in etwa 2 bis 3 Wochen. Entnehmen Sie Kolonien mit geeigneter Morphologie mit Pipetten aus gebranntem Glas, schließen Sie möglicherweise kontaminierende Zellen aus, und aspirieren Sie die Kolonien mit 200-μl-Spitzen
      14. .

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
B27 Beilage Invitrogen17504044
CHIR99021Gen-OperationTel.: 04-0004
DMEM-F12GibcoArtikel-Nr.: 11330
DMEM-F12GibcoArtikel-Nr.: 11320
LamininRoche 11243217001
N2-Ergänzung Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Nicht-essentielle Aminosäure
NeurobasalGibcoArtikel-Nr.: 10888Grundlegendes Medium
pdlSigma-AldrichNr. 7280Poly-D-Lysin
SB431542Gen-Operation04-0010-10mgBei -20 Grad vor Licht lagern?
Sendai-VirusLebenstechnologienMAN0009378
InsulinRoche 12585014
24-Well-PlatteCorning3337
Konisches 15-ml-RöhrchenCorning430052
6-Well-PlatteCorning3516
EPOPeprotech100-64-50UGHumanes Erythropoietin
Humaner Leukämie-HemmfaktorMillporeLIF1010
Humane rekombinante SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGHumaner insulinähnlicher Wachstumsfaktor
IL-3Peprotech200-03-10UGHumanes Interleukin 3
DexamethasonSigma-AldrichD2915-100MG
IMDMGibcoArtikel-Nr.: 215056-023Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium
InsulinRoche 12585014
ITS-XInvitrogenArtikel-Nr.: 51500-056Insulin-Transferrin-Selen-X-Ergänzung
GlutaMAXInvitrogen21051024100 × Glutamin-Stammlösung
Ham's-F12GibcoArtikel-Nr.: 11765-054
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145Giftig für Inhalation und Hautkontakt
AscorbinsäureSigma-AldrichNr. A92902Giftig bei Hautkontakt
Knockout-Serum-ErsatzGibco10828028Serumfreies Basalmedium
Chemisch definiertes LipidkonzentratInvitrogen11905031
ÜbertragenF&E-Systeme2914-HT-100G
Trypan-BlauGibcoNr. T10282
kg kg

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Schlagwörter

Reprogrammierung mittels Sendai VirusZellreprogrammierungsverfahrenKoloniebildung von iNSCsPoly D Lysin Laminin BeschichtungZellz hlung mit TrypanblauMultiplizit t der Infektion 10iNSC MediensupplementierungKolonie Picking Methode

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