Isolierung von zirkulierender zellfreier DNA (cfDNA): Ein Membranverfahren auf Siliziumdioxidbasis zur Extraktion von cfDNA aus Blutplasma von Krebspatienten

Zusammenfassung

Quelle: Palande, V. et al. Nachweis von zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video beschreibt ein Membranverfahren auf Siliziumdioxidbasis zur Isolierung von zirkulierender zellfreier DNA oder cfDNA aus menschlichen Plasmaproben. Die cfDNA ist ein vielversprechender Biomarker für die Diagnose und Beurteilung von Krebs.

Protokoll

Alle Eingriffe, an denen menschliche Teilnehmer beteiligt sind, wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

1. Aufreinigung von zirkulierender cfDNA aus 1 ml Plasma

HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem handelsüblichen Kit durchgeführt (siehe Materialtabelle). Alle Puffer werden mit dem Kit mitgeliefert.

1. Vorbereitung von Puffern und Reagenzien
   Vorsicht: Geben Sie keine sauren Lösungen oder Bleichmittel direkt in die Abfälle der Probenvorbereitung. Guanidinsalze, die in Lysepuffer, Bindungspuffer und Waschpuffer-1 enthalten sind, können in Kombination mit Bleiche oder Säuren hochreaktive Verbindungen erzeugen.
   1. Bindungspuffer: Mischen Sie 300 ml Bindepufferkonzentrat mit 200 ml 100% Isopropanol, um 500 ml Arbeitspuffer herzustellen. Bei Raumtemperatur lagern.
      Anmerkung: Der Bindungspuffer ermöglicht die optimale Bindung der zirkulierenden Nukleinsäuren an die Kieselsäuremembran. 500 mL des Bindungspuffers reichen für die Verarbeitung von 276, 138, 92, 69 oder 55 Proben von 1, 2, 3, 4 oder 5 mL Plasma aus und sind bei Raumtemperatur 1 Jahr lang stabil.
   2. Waschpuffer-1: Mischen Sie 19 ml Waschpuffer-1-Konzentrat mit 25 ml 96–100 % Ethanol, um 44 ml Arbeitswaschpuffer-1 herzustellen. Bei Raumtemperatur lagern.
      Anmerkung: Wash Buffer-1 eliminiert die an die Kieselsäuremembran gebundenen Verunreinigungen. 44 ml Arbeitswaschpuffer-1 reichen für die Verarbeitung von 73 Proben mit 1/2/3/4/5 ml Plasma aus und sind bei Raumtemperatur 1 Jahr lang stabil.
   3. Waschpuffer-2: 13 ml Waschpuffer-2-Konzentrat mit 30 ml 96–100 % Ethanol gut mischen, um 43 ml Arbeitswaschpuffer-2 herzustellen. Bei Raumtemperatur lagern.
      Anmerkung: Wash Buffer-2 eliminiert die an die Kieselsäuremembran gebundenen Verunreinigungen. 43 mL Arbeitswaschpuffer-2 reichen für die Verarbeitung von ~56 Proben von 1/2/3/4/5 mL Plasma aus und sind 1 Jahr bei Raumtemperatur stabil.
   4. In ein Röhrchen mit 310 μg lyophilisierter Träger-RNA geben Sie 1.550 μl Elutionspuffer, um eine Träger-RNA-Lösung von 0,2 μg/μl herzustellen. Nach gründlichem Auflösen der Träger-RNA wird die Lösung in geeignete Aliquote aufgeteilt und bei -30 °C bis -15 °C gelagert. Frieren und tauen Sie diese Aliquots nicht mehr als 3 Mal ein. Zu dem Lysepuffer, wie in Tabelle 1 gezeigt, wird die rekonstituierte Träger-RNA hinzugefügt, die im Elutionspuffer gelöst ist.
      Anmerkung: Da sich Träger-RNA nicht direkt im Lysepuffer auflöst, muss sie zuerst in einem Elutionspuffer und dann in einem Lysepuffer gelöst werden. Erstens wird die Bindung zwischen Siliziumdioxidmembran und Nukleinsäuren verbessert, wenn nur sehr wenige Zielmoleküle in der Probe vorhanden sind. Zweitens wird das Risiko eines RNA-Abbaus aufgrund des Vorhandenseins großer Mengen an Träger-RNA reduziert.
2. Bevor Sie mit der Isolierung beginnen, bringen Sie die Säulen und Proben auf Raumtemperatur und stellen Sie das Probenvolumen bei Bedarf mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf 1 ml ein. 2 Wasserbäder oder Heizblöcke, die 50 mL Zentrifugenröhrchen und 2 mL Entnahmeröhrchen enthalten, auf 60 °C bzw. 56 °C vorheizen.
3. In ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen werden 100 μl Proteinase K, 1 ml Plasma und 0,8 ml Lysepuffer mit 1,0 μg Träger-RNA (hergestellt in Schritt 1.1.4) gegeben. Verschließen Sie das Zentrifugenröhrchen mit einer Kappe und mischen Sie den Inhalt durch Pulswirbeln für 30 s, wobei Sie auf einen sichtbaren Wirbel im Röhrchen achten. Eine gründliche Durchmischung des Inhalts ist wichtig für eine effiziente Lyse.
   Anmerkung: Fahren Sie unmittelbar nach dem Vortexen ohne Verzögerung mit Schritt 1.4 fort.
4. Die Lösung 30 min lang bei 60 °C inkubieren.
5. Entfernen Sie die Kappe, geben Sie 1,8 mL des Bindungspuffers in das Röhrchen und mischen Sie es nach dem Aufsetzen der Kappe 15–30 s lang gründlich mit Impulswirbel.
6. Inkubieren Sie die resultierende Mischung 5 Minuten lang auf Eis und setzen Sie die Kieselsäuremembransäule in die Vakuumapparatur ein, die mit der Vakuumpumpe verbunden ist. Setzen Sie dann einen 20-ml-Röhrchen-Extender fest in die offene Säule ein, um ein Auslaufen der Probe zu verhindern.
7. Gießen Sie die inkubierte Mischung vorsichtig in den Schlauchverlängerer der Säule und schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Nachdem das gesamte Lysatgemisch vollständig durch die Säulen gelaufen ist, schalten Sie die Vakuumpumpe aus, lassen Sie den Druck auf 0 mbar los und entfernen und entsorgen Sie den Schlauchverlängerer.
   Anmerkung: Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, sollte der Röhrenverlängerer vorsichtig entsorgt werden, um eine Ausbreitung auf benachbarte Säulen zu verhindern.
8. Nehmen Sie die Säule aus dem Vakuumgerät, setzen Sie sie in das Sammelröhrchen ein und zentrifugieren Sie bei 11.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um jegliches Restlysat zu entfernen. Verwerfen Sie den Durchfluss.
9. 600 μl Waschpuffer-1 in die Säule geben, 1 min bei Raumtemperatur bei 11.000 x g zentrifugieren, den Durchfluss verwerfen.
10. Geben Sie 750 μl Waschpuffer-2 in die Säule, zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei Raumtemperatur bei 11.000 x g und verwerfen Sie den Durchfluss.
11. Geben Sie 750 μl Ethanol (96–100 %) in die Säule, zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei Raumtemperatur bei 11.000 x g und verwerfen Sie den Durchfluss.
12. Zentrifugieren Sie die Säule 3 Minuten lang bei 20.000 x g, indem Sie sie in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen legen.
13. Trocknen Sie die Membransäulenbaugruppe vollständig, indem Sie sie bei geöffnetem Deckel in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen legen und 10 Minuten lang bei 56 °C inkubieren.
14. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Elutionsröhrchen. 20–150 μl Elutionspuffer in die Mitte der Säulenmembran geben und 3 Minuten bei geschlossenem Deckel bei Raumtemperatur inkubieren.
    Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der Elutionspuffer auf Raumtemperatur ausgeglichen ist. Bei der Verwendung von Elutionspuffer mit einem Gehalt von weniger als 50 μl ist darauf zu achten, dass dieser vorsichtig auf die Mitte der Membran abgegeben wird. Dies hilft bei der vollständigen Elution der gebundenen DNA. Das Elutionsvolumen ist jedoch nicht festgelegt und kann je nach nachgelagerter Anwendung geändert werden. Das zurückgewonnene Eluat kann bis zu 5 μl betragen und sicherlich geringer als das Elutionsvolumen, das auf die Säule aufgetragen wird.
15. Das zurückgewonnene Eluat wird in einer Mikrozentrifuge bei 20.000 x g für 1 min zentrifugiert, um die Nukleinsäuren zu eluieren, und bei -20 °C gelagert.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Anzahl der Proben	Lyse-Puffer (ml)	Träger-RNA im Elutionspuffer (μL)
1	0,9	5,6
arabische Ziffer	1,8	11,3
3	2,6	16,9
4	3,5	22,5
5	4,4	28,1
6	5,3	33,8
7	6.2	39,4
8	7	45
9	7,9	50,6
10	8,8	56,3
11	9,7	61,9
12	10,6	67,5
13	11,4	73,1
14	12.3	78,8
Nr. 15	13,2	84,4
16	14.1	90
17	Nr. 15	95,6
18	15,8	101,3
19	16,7	106,9
20	17,6	112,5
21	18,5	118,1
22	19,4	123,8
23	20,2	129,4
24	21.1	Nr. 135

Tabelle 1. Volumina von Lysepuffer und Träger-RNA (gelöst in Elutionspuffer), die für die Verarbeitung von 1-ml-Plasmaproben erforderlich sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agilent DNA-Kit mit hoher Empfindlichkeit	Agilent Technologies, Inc.	Tel.: 5067-4626	Die hochempfindlichen DNA-Assays werden häufig zur Probenqualitätskontrolle für Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation verwendet.
cf-DNA/cf-RNA Konservierungsmittel-Röhrchen	Norgen Biotek Corp.	Artikel-Nr.: 63950	Die cf-DNA/cf-RNA Konservierungsröhrchen von Norgen sind geschlossene, evakuierte Kunststoffröhrchen für die Entnahme und Konservierung von cfDNA, zirkulierender Tumor-DNA, cf-RNA und zirkulierenden Tumorzellen in menschlichen Vollblutproben während der Lagerung und des Versands
QIAamp Kit für zirkulierende Nukleinsäuren	Qiagen	Artikel-Nr.: 55114	Das QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit ermöglicht die effiziente Aufreinigung dieser zirkulierenden Nukleinsäuren aus menschlichem Plasma oder Serum und anderen zellfreien Körperflüssigkeiten.
QIAvac 24 Plus Vakuumverteiler	Qiagen	Nr. 19413	Der QIAvac 24 Plus Vakuumverteiler ist für die parallele Vakuumbearbeitung von QIAGEN Säulen ausgelegt.
QIAvac Verbindungssystem	Qiagen	Nr. 19419	In Kombination mit dem QIAvac Connecting System kann der QIAvac 24 Plus Vakuumverteiler als Durchflusssystem eingesetzt werden. Der Probendurchfluss, der möglicherweise infektiöses Material enthält, wird in einer separaten Abfallflasche gesammelt.
QIAvac Verbindungssystem	Qiagen	Nr. 19419	In Kombination mit dem QIAvac Connecting System kann der QIAvac 24 Plus Vakuumverteiler als Durchflusssystem eingesetzt werden. Der Probendurchfluss, der möglicherweise infektiöses Material enthält, wird in einer separaten Abfallflasche gesammelt.
Verschiedenes
50 mL Zentrifugenröhrchen
Zerstoßenes Eis
Ethanol (96–100 %)
Heizblock oder ähnliches bei 56 °C (kann 2 mL Sammelröhrchen aufnehmen)
Isopropanol (100%)
Mikrozentrifuge
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
Pipetten (verstellbar)
Sterile Pipettenspitzen (Pipettenspitzen mit Aerosolbarrieren werden empfohlen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden)
Wasserbad oder Heizblock, der 50 mL Zentrifugenröhrchen bei 60 °C aufnehmen kann