Automatisierte Kapillarelektrophorese-basierte Analyse der Fragmentgrößenverteilung von cfDNA: eine DNA-Mikrochip-basierte Methode zur Untersuchung der Größenverteilung von DNA-Fragmenten, die aus Bioflüssigkeiten isoliert wurden

Zusammenfassung

Quelle: Palande, V. et al. Nachweis von zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten. J. vis. exp. (2020)

In diesem Video analysieren wir die Größenverteilung von zellfreien DNA- oder cfDNA-Fragmenten mittels automatisierter Kapillarelektrophorese. Diese Technik hilft, Einblicke in das Profil von DNA-Fragmenten zu gewinnen, die von Krebszellen während der Apoptose freigesetzt werden.

Protokoll

>1. Größenverteilung der DNA-Fragmente von cfDNA mit dem Fragmentanalysator

1. Der Schritt vor Einleitung des Verfahrens: Äquilibrieren Sie das DNA-Farbstoffkonzentrat und die DNA-Gel-Matrix für 30 Minuten auf Raumtemperatur.
2. Vorbereitung der Gel-Färbemischung
   Anmerkung: Gehen Sie mit Lösungen vorsichtig um, da DMSO dafür bekannt ist, das Eindringen organischer Moleküle in das Gewebe zu erleichtern.
   1. Tauen Sie das DMSO gründlich auf, indem Sie das Fläschchen mit dem DNA-Farbstoffkonzentrat 10 s lang vortexen. Pipettieren Sie 15 μl dieses Konzentrats in ein DNA-Gelmatrix-Fläschchen und lagern Sie es bei 4 °C im Dunkeln.
   2. Nochmals, das verschlossene Fläschchen 10 s lang vortexen, bis das Mischen von Gel und Farbstoff sichtbar ist.
   3. Gieße die Mischung auf einen Schleuderfilter in den oberen Behälter.
   4. Mikrozentrifugieren Sie den Spin-Filter bei 2.240 x g ± 20 % für 10 min bei Raumtemperatur.
   5. Beschriften Sie den vorbereiteten Gelfarbstoff in der Tube und entsorgen Sie den Filter gemäß der guten Laborpraxis. Beschriften Sie die Tube und notieren Sie das Datum der Zubereitung.
      Anmerkung: Entsorgen Sie das Filtrat gemäß der guten Laborpraxis. Die Gel-Farbstoff-Mischung kann für 5 High Sensitivity (HS) DNA-Chips verwendet werden. Bei Nichtgebrauch von mehr als 1 h bei 4 °C lagern. Eine Lagerung im Dunkeln ist bis zu 6 Wochen möglich.
3. Um die Gel-Farbstoff-Mischung zu laden, stellen Sie sicher, dass sich die Grundplatte der Chip-Priming-Station befindet, und stellen Sie den Clip auf die niedrigste Position ein.
   1. Äquilibrieren Sie die Gel-Farbstoff-Mischung 30 Minuten lang auf Raumtemperatur und überwachen Sie dabei die Lichteinwirkung.
   2. Nehmen Sie einen neuen HS-DNA-Chip aus einem versiegelten Beutel und legen Sie ihn auf die Chip-Priming-Station, entfernen Sie dann 9,0 μl der Gel-Farbstoff-Mischung und geben Sie sie am Boden der Chip-Vertiefung ab, die als "G" gekennzeichnet ist.
      Anmerkung: Ziehen Sie die Gel-Farbstoff-Mischung auf und vermeiden Sie Partikel, die sich am Boden des Fläschchens ansammeln können. Während Sie die Gel-Farbstoff-Mischung in die Vertiefung des HS-DNA-Chips geben, führen Sie die Spitze der Pipette vollständig ein, um die Bildung großer Luftblasen zu verhindern. Darüber hinaus führt das Berühren der Pipette an den Rändern der Vertiefung zu schlechten Ergebnissen.
   3. Positionieren Sie den Kolben auf 1 mL und schließen Sie die Chip-Ansaugstation. Stellen Sie sicher, dass die Verriegelung der Falle einrastet, und stellen Sie den Timer auf 60 s ein, drücken Sie dann den Stößel nach unten, bis er vom Clip gehalten wird, und lassen Sie den Stößel genau nach 60 s mit dem Clip-Entriegelungsmechanismus los.
   4. Wenn sich der Kolben mindestens bis zur 0,3-ml-Markierung zurückgezogen hat, warten Sie 5 s und ziehen Sie ihn dann langsam in die 1-ml-Position zurück, öffnen Sie dann die Chip-Priming-Station und entfernen Sie erneut 9,0 μl der Gel-Farbstoff-Mischung und geben Sie sie an den Boden der HS-DNA-Chip-Vertiefung, die als "G" gekennzeichnet ist.
4. Um den DNA-Marker zu laden, geben Sie 5 μl des DNA-Markers in die Vertiefung, die mit dem Leitersymbol gekennzeichnet ist. Wiederholen Sie den Vorgang für alle 11 Probenvertiefungen.
5. Um die Leiter und die Proben zu laden, geben Sie 1 μl der DNA-Leiter in die Vertiefung, die mit dem Leitersymbol gekennzeichnet ist, und fügen Sie dann 1 μl Probe (verwendete Vertiefungen) oder 1 μl Marker (unbenutzte Vertiefungen) in alle 11 Probenvertiefungen hinzu.
6. Vortexen Sie den HS DNA-Chip für 60 s bei 2.400 U/min, indem Sie den Chip horizontal im Adapter platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Ausbuchtung, die den HS-DNA-Chip fixiert, während des Vortexens nicht beschädigt wird.
7. Um den HS-DNA-Chip in das Fragmentanalysegerät einzusetzen, öffnen Sie den Deckel und vergewissern Sie sich, dass die Elektrodenpatrone richtig eingesetzt ist und der Chipwähler auf "dsHigh Sensitivity DNA" im Fragmentanalysegerät positioniert ist.
8. Montieren Sie den HS-DNA-Chip vorsichtig in die Buchse, die nur in eine Richtung passt, und schließen Sie dann den Deckel, indem Sie sicherstellen, dass die Elektrodenpatrone genau in die Vertiefungen des HS-DNA-Chips passt.
9. Die Anzeige auf dem Bildschirm der Fragmentanalysator-Software zeigt den eingesetzten HS-DNA-Chip und den geschlossenen Deckel durch das Chip-Symbol oben links auf dem Bildschirm an.
10. Um den HS-DNA-Chip-Lauf zu starten, wählen Sie den dsDNA-Hochempfindlichkeits-Assay aus dem Menü "Assay" auf dem Gerätebildschirm aus, füllen Sie dann die Tabelle mit den Probennamen ordnungsgemäß aus, indem Sie Informationen wie Probennamen und Kommentare eingeben, und starten Sie den Chip-Lauf, indem Sie auf die Schaltfläche "Start" oben rechts auf dem Bildschirm klicken.
11. Elektrodenreinigung nach einem HS-DNA-Chip-Lauf: Entfernen Sie den gebrauchten HS-DNA-Chip sofort, sobald der Assay abgeschlossen ist, und entsorgen Sie ihn gemäß der guten Laborpraxis. Führen Sie das folgende Verfahren durch, um sicherzustellen, dass die Elektroden sauber sind und keine Rückstände vom vorherigen Assay übrig bleiben.
    1. Füllen Sie langsam 350 μl deionisiertes Wasser in Analysequalität in eine der Vertiefungen des Elektrodenreinigers und setzen Sie den Elektrodenreiniger in das Fragmentanalysegerät ein, indem Sie den Deckel öffnen, dann den Deckel schließen und etwa 10 s warten.
    2. Entfernen Sie den Elektrodenreiniger, indem Sie den Deckel öffnen, und warten Sie weitere 10 Sekunden, bis das Wasser auf den Elektroden verdunstet ist, bevor Sie den Deckel schließen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2100 Bioanalysegerät	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	Das 2100 Bioanalyzer-System ist ein etabliertes automatisiertes Elektrophorese-Tool für die Qualitätskontrolle von Biomolekülen in Proben.
Verstellbarer Clip für Ansaugstation	Agilent Technologies, Inc.	Tel.: 5042-1398	Wird in Kombination mit einer Spritze verwendet, um einen definierten Druck für die Chip-Grundierung auszuüben.
cf-DNA/cf-RNA Konservierungsmittel-Röhrchen	Norgen Biotek Corp.	Artikel-Nr.: 63950	Die cf-DNA/cf-RNA-Konservierungsröhrchen von Norgen sind geschlossene, evakuierte Kunststoffröhrchen für die Entnahme und Konservierung von cf-DNA, zirkulierender Tumor-DNA, cf-RNA und zirkulierenden Tumorzellen in menschlichen Vollblutproben während der Lagerung und des Versands
Chip-Priming-Station	Agilent Technologies, Inc.	Tel.: 5065-4401	Wird verwendet, um die Gelmatrix mit einer Spritze, die mit jedem Assay-Kit geliefert wird, in einen Chip zu laden – wird für RNA-, DNA- und Protein-Assays verwendet. Inklusive Ansaugstation, Stoppuhr und 1 Spritzenclip
Elektroden-Reinigungsset	Agilent Technologies, Inc.	Tel.: 5065-9951	Verhindert Kreuzkontaminationen. Entfernt bakterielle oder proteinische Verunreinigungen von Elektroden.
Filter für Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	Tel.: 185-5990	Wird zum richtigen Mischen von DNA-Farbstoffkonzentrat und DNA-Gel-Matrix verwendet
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Wird zum ordnungsgemäßen Mischen von DNA-Leiter und DNA-Probe auf Bioanalyzer-Assay-Chips verwendet
50 ml Zentrifugenröhrchen
Ethanol (96–100 %)
Heizblock o.ä. bei 56 °C (für 2 ml Sammelröhrchen)
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
Pipetten (verstellbar)
Sterile Pipettenspitzen (Pipettenspitzen mit Aerosolbarrieren werden empfohlen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden)
Wasserbad oder Heizblock, der 50 mL Zentrifugenröhrchen bei 60 °C aufnehmen kann