Tröpfchen-Digitalpolymerase-Kettenreaktion: Eine Methode zur Erzeugung von Nanotröpfchen-PCR-Reaktionen zum Nachweis seltener Tumormutationen

Zusammenfassung

Quelle: Bonner, E. R. et al. Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Patienten-Bioflüssigkeiten. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von emulgierten Nanotröpfchen zum Nachweis von Zielnukleinsäuren durch digitale Polymerase-Kettenreaktion oder dPCR.

Protokoll

>1. Nachweis und Quantifizierung von Ziel-DNA mittels dPCR

1. Bereiten Sie die dPCR-Reaktionsmischung für 8 Vertiefungen des PCR-Streifenröhrchens plus 10 % extra vor, indem Sie 220 μl Genotypisierungs-Mastermix, je 8,8 μl 10 μM Wildtyp- und Mutantensonden, je 39,6 μl 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 17,6 μl Tröpfchenstabilisierungsöl hinzufügen.
2. Mischen Sie das dPCR-Reaktionsgemisch vorsichtig, indem Sie das gesamte Volumen 10–20 Mal auf und ab pipettieren. Nicht vortexen oder zentrifugieren, nachdem dem Reaktionsgemisch tröpfchenstabilisierendes Öl zugesetzt wurde.
3. Besorgen Sie sich ein PCR-Streifenröhrchen mit 8 Vertiefungen und geben Sie 38 μl dPCR-Reaktionsgemisch direkt in den Boden jedes Wells. Entfernen Sie alle Blasen mit einer sauberen Pipettenspitze.
   HINWEIS: PCR-Streifenröhrchen, die ineinander verzahnt oder dicht gepackt sind, können zu statischen elektrischen Aufladungen führen, die bei der Analyse von dPCR-Daten zu Koaleszenz und verrauschten Signalen führen. Um dies zu vermeiden, aliquotieren Sie die Röhrchen in separate Beutel für biologische Gefahren, vermeiden Sie ein Überfüllen der Beutel und verhindern Sie, dass die Röhrchen aneinander reiben.
4. Geben Sie 12 μl der voramplifizierten DNA-Probe in die entsprechenden Vertiefungen des PCR-Streifenröhrchens. Für die Negativkontrolle werden 12 μl MB H₂O.
   HINWEIS: Analysieren Sie cfDNA-Proben in Replikat-Wells. Bei Liquor ist mindestens in doppelter Ausführung zu analysieren, bei Plasma/Serum ist jede Probe in dreifacher Ausfertigung zu analysieren.
5. Pipettieren Sie das gesamte Volumen vorsichtig 10 Mal auf und ab, um das Reaktionsgemisch mit der DNA-Probe zu mischen.
6. Besorgen Sie sich einen neuen Tröpfchen-erzeugenden Instrumentenchip und pipettieren Sie das gesamte Volumen aus den Wells 1–8 des PCR-Streifenröhrchens in die entsprechenden Kanäle A–H im Chip. Vermeiden Sie es, den Boden der Kanäle mit einer Pipettenspitze zu berühren.
7. Besorgen Sie sich ein neues, sauberes PCR-Streifenröhrchen und setzen Sie es in das tröpfchenerzeugende Instrument ein. Scannen Sie die ID des tröpfchenerzeugenden Instrumentenchips oder geben Sie sie manuell in die Software auf dem Gerätecomputer ein. Geben Sie Namen für jeden der 8 Kanäle ein. Klicken Sie auf Ausführung starten, um mit der Tröpfchenbildung von Proben zu beginnen.
8. Wenn die Tröpfchenbildung abgeschlossen ist, entfernen Sie das PCR-Streifenröhrchen und setzen Sie die Kappen des Streifenröhrchens auf.
9. Übertragen Sie das Streifenröhrchen in einen Thermocycler und balancieren Sie es mit einem anderen Streifenröhrchen mit 80 μl Wasser pro Vertiefung aus.
10. Die Temperaturwechselbedingungen werden wie folgt programmiert: 95 °C für 10 Minuten; 45 Zyklen mit zwei Temperaturen: 95 °C für 30 s und Glühtemperatur für 2 Minuten; 98 °C für 10 Minuten; und halten Sie sie bei 10 °C.
    1. Stellen Sie die Rampenrate auf 0,5 °C/s und das Probenvolumen auf 80 μl ein.
11. Wenn die Temperaturwechsel abgeschlossen sind, entfernen Sie das Streifenrohr und geben Sie es in das Quantifizierungsgerät. Entfernen Sie die PCR-Streifenkappen und ersetzen Sie sie durch Hochgeschwindigkeitsverschlüsse.
12. Schalten Sie das Quantifizierungsgerät und den angeschlossenen Computer mit der Gerätesoftware ein. Starten Sie die Gerätesoftware und klicken Sie auf Ausführung einrichten.
13. Setzen Sie das Streifenröhrchen in das Quantifizierungsinstrument ein.
14. Besorgen Sie sich einen neuen Chip für das Quantifizierungsinstrument und scannen Sie die Chip-ID oder geben Sie sie manuell in das Gerät ein. Setzen Sie den Chip in die Maschine ein.
15. Setzen Sie die Metallabschirmung auf den Chip und schließen Sie den Deckel des Geräts.
16. Geben Sie in der Computersoftware einen Namen für den dPCR-Lauf und für jeden der 8 Kanäle (A–H) ein. Wählen Sie den Schnellmodus aus (der mit High-Speed-Caps verwendet werden muss) und klicken Sie auf Start, um mit der Quantifizierung zu beginnen.
17. Wenn die Quantifizierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Metallabschirmung (zur Aufbewahrung und Wiederverwendung) und entsorgen Sie das PCR-Streifenröhrchen und den Chip. Auf dem Gerätecomputer enthält das Ablaufprotokoll Ergebnisdateien für jeden Lauf. Verwenden Sie die .fcs-Dateien für jede Stichprobe, um sie mit der Analystensoftware zu analysieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Raindance Verbrauchsmaterial-Set	Bio-Rad	Tel.: 20-04411	Enthält Tröpfchen-erzeugende Instrumentenchips, Quantifizierungs-Instrumentenchips, PCR-Strip-Kappen einschließlich Hochgeschwindigkeits-Kappen und Tröpfchen-Stabilisierungsöl
Raindance Sense Instrument	Bio-Rad		Instrument zur Quantifizierung
Raindance Source Instrument	Bio-Rad		Tröpfchenerzeugendes Instrument
RainDrop Analyst II Software	RainDance-Technologien		Analystensoftware für die Datenanalyse
Thermomischer C	Eppendorf	14 285 562 Uhr
MiniAmp Thermocycler	Thermofisher Scientific	Nr. A37834
PCR 8-Well-Streifenkappen für Röhrchen	VWR	Tel.: 10011-786
PCR 8-Well-Streifenröhrchen	Axygen	PCR-0208-C
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Mastermix	New England Biolabs Inc	M0494S