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>1. Vorbereitung von Zellkulturen und Gerüsten
HINWEIS: Gerüste sollten 48 Stunden vor der Implantation bei Mäusen vorbereitet werden. Die folgenden Volumina werden pro Gerüst bereitgestellt. Multiplizieren Sie die Mengen nach Bedarf für zusätzliche Gerüste.
- Schneiden Sie Gerüste aus Polymilchsäure (PLA) in resektionshohlraumgroße Stücke (ca. 2 mm x 2 mm). Gerüste können von Hand mit einer Schere oder mit einem Locher geschnitten werden, um die Wiederholgenauigkeit zu gewährleisten.
- Sterilisieren, indem Sie 15 Minuten lang in 70%iges Ethanol eintauchen, gefolgt von einem Eintauchen in PBS. Platzieren Sie das Gerüst in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), das 10 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, während Sie die Zellen für die Aussaat vorbereiten.
- Kultivierte MSCs werden mit 0,05 % Trypsin (3–5 ml für einen T75-Kolben) angehoben. Bei 37 °C 5 min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen angehoben haben, und geben Sie dann 7–10 ml DMEM in den Kolben, um Trypsin zu inaktivieren.
- Der Inhalt des Kolbens wird in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Pellet 5 x 105 MSC für jedes Gerüst durch Zentrifugation bei 100 x g für 5 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie MSCs in 5 μl DMEM pro 5 x 105 Zellen.
- Bereiten Sie die Gerüste für die Aussaat vor, indem Sie sie trocken tupfen.
- Entfernen Sie ein Gerüst aus dem DMEM-Eintauchen mit einer Pinzette und legen Sie es vorübergehend auf den Deckel der 6-Well-Platte. Heben Sie das Gerüst vom Deckel ab und hinterlassen Sie ein Tröpfchen überschüssiges DMEM.
- Stellen Sie das Gerüst wieder auf den Deckel an einem neuen, trockenen Ort. Wiederholen Sie dies 3–5 Mal und legen Sie dann das teilweise getrocknete Gerüst für die Aussaat in eine neue 6-Well-Platte. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Gerüst.
Anmerkung: Ein teilgetrocknetes Gerüst sorgt für optimale Ergebnisse bei der Zellaussaat. Wenn das Gerüst zu nass ist, rutschen die Zellen vom Gerüst und haften an der darunter liegenden Well-Platte. Wenn das Gerüst zu trocken ist, breitet sich das Tröpfchen nicht über das gesamte Gerüst aus, was zu einer schlechten anfänglichen Zellverteilung führt.
- Mischen Sie das Fläschchen mit den Stammzellen vorsichtig mit einer Pipette, um die Suspension zu homogenisieren, da sich einige Zellen am Boden abgesetzt haben könnten.
- Pipettieren Sie langsam 2,5 μl frisch gemischte MSC-Suspension direkt auf das Gerüst, so dass ein kleiner Tropfen über dem Gerüst entsteht.
- Geben Sie 300 μl DMEM an die Ränder jeder Vertiefung. Dadurch wird eine schnelle Verdunstung des Zelltröpfchens verhindert. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Zellen am Gerüst befestigen können.
- Drehen Sie die Gerüste mit einer Pinzette vorsichtig in der Vertiefungsplatte um. Aussaat 2,5 μl frisch gemischte MSC-Suspension (daraus ergeben sich insgesamt 5 x 105 besäte Zellen pro Gerüst). Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, damit sich die Zellen am Gerüst befestigen können.
- Decken Sie die Gerüste mit DMEM ab, indem Sie 2 ml in jede Vertiefung der 6-Well-Platte geben. Heben Sie die Gerüste vorsichtig an, damit das Medium darunter fließen kann. Inkubieren Sie in diesem Zustand 48 Stunden lang bei 37 °C, bevor Sie die Implantation durchführen.
- Überprüfen Sie die Gerüste nach 24 h und fügen Sie das Medium hinzu/wechseln Sie es, wenn übermäßige Verdunstung oder verfärbte Medien aufgrund eines pH-Ungleichgewichts festgestellt werden.