Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Fluoreszenzgesteuerte Resektion und Gerüstimplantation
HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Werkzeuge vor der Initialisierung der Operation.
- Platzieren Sie den stereotaktischen Rahmen auf dem Tisch eines fluoreszenzdisparierenden Stereomikroskops.
- Betäuben Sie die Maus unter inhaliertem Isofluran in einer Induktionskammer. Nach der Betäubung befestigen Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen mit kontinuierlicher Inhalationsanästhesie über einen Isofluran-Nasenkonusadapter. Halten Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen und/oder einer Sonde aufrecht.
HINWEIS: 4–5 % Isofluran sind für die Induktion und 2–3 % für die Wartung geeignet, dies muss jedoch für jede Maus angepasst und überwacht werden.
- Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Sterilisieren Sie die Inzisionsstelle der Kopfhaut mit einer Reihe von drei Alkohol- und drei Betadin-Tüchern.
- Führen Sie einen Zehenquetschreflextest an jeder Gliedmaße durch und bestätigen Sie die negative Reaktion, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten. Sorgen Sie für eine gleichmäßige Atemfrequenz von ca. 55–65 Atemzügen/min.
- Mit einer Pinzette die Kopfhaut zusammendrücken und sanft anheben. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen linearen rostral-kaudalen Schnitt in der Mittellinie. Spülen Sie die Inzisionsstelle mit PBS und entfernen Sie subdermales Fett mit einem Wattestäbchenapplikator in kreisenden Bürstenbewegungen. Ordnen Sie die Haut so an, dass das zuvor etablierte Schädelfenster vollständig sichtbar ist.
- Stechen Sie die Dura mit einer 18G-Nadel vorsichtig bis zu den Rändern des Schädelfensters ein. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der Schnitt das Innere des Fensters vollständig nachzeichnet.
- Entfernen Sie die Dura, indem Sie sie mit einer feinen Pinzette abziehen, wodurch das darunterliegende Parenchym und der Tumor zum Vorschein kommen.
- Lokalisieren Sie den U87 mCh-Fl-Tumor, indem Sie die Raumbeleuchtung ausschalten und den Stereomikroskop-Fluoreszenzmodus einschalten. Bereiten Sie die Resektion vor, indem Sie eine Pipettenspitze von 1–200 μl in das Ende des Schlauchs einer Vakuumpumpe einlegen.
- Schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Sezieren Sie den Tumor durch sanftes Ansaugen von fluoreszierendem Gewebe, bis kein Signal mehr vorhanden ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus und entsorgen Sie die Pipettenspitze. Schalten Sie die Fluoreszenz aus und die Raumbeleuchtung wieder ein.
HINWEIS: Um Blutungen zu kontrollieren, spülen Sie mit kaltem PBS und üben Sie mit einem Wattestäbchenapplikator gleichmäßigen Druck aus. In schwereren Fällen kann die Resektionshöhle auch vorübergehend mit einem Blutstillungsmittel gefüllt werden, sofern es nach Beendigung der Blutung entfernt wird, gefolgt von einer weiteren PBS-Spülung.
- Tauchen Sie unmittelbar vor der Implantation ein mit MSC gesätes PLA-Gerüst langsam in PBS, um unerwünschte Medien und zugehörige Komponenten zu entfernen. Implantieren Sie das Gerüst in die Resektionshöhle. Fügen Sie bei Bedarf 1 μl Fibrinogen (67–106 mg/ml) gefolgt von 1 μl Thrombin (400–625 U/ml) hinzu, um das Gerüst an Ort und Stelle zu halten.
- Nachdem Sie die Dura entfernt und den Knochenlappen aus dem Schädelfenster bereits entsorgt haben, versiegeln Sie die Wunde, indem Sie einfach die Haut schließen und chirurgischen Kleber auftragen. Nehmen Sie das Tier aus der Inhalationsnarkose und lassen Sie es auf einer erhitzten Oberfläche erholen.
