Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Markierung von Glioblastomzellen mit FP635 oder FP720 Konstrukt
- Produzieren und reinigen Sie Lentiviren gemäß dem unten beschriebenen Protokoll:
- Beobachten Sie die Gerichte, die an Tag 1 ausgesät werden. Wenn die Zellen zu 80–90 % konfluent sind, sind sie bereit für die Transfektion.
HINWEIS: Die Zellen sollten noch Platz für 1-2 Zellteilungen haben
- Bereiten Sie die Plasmidmischung vor, indem Sie die vier Plasmide in ein 50-ml-Röhrchen aliquotieren. Für die Zubereitung eines Tellers von 12 × 15 cm verwenden Sie 270 μg Transfervektor, 176 μg pMDL (Gag/Pol), 95 μg pVSVG (Glykoprotein des vesikulären Stomatitisvirus) und 68 μg pREV.
- Bereiten Sie 13,5 ml 0,25 M CaCl2 vor (verdünnen Sie es mit filtriertem ddH2O) und fügen Sie es der Plasmidmischung hinzu. Fügen Sie 13,5 mL 2× BBS-Lösung hinzu. Vorsichtig mischen, mehrmals umdrehen und 15 min bei Raumtemperatur (22–26°) inkubieren.
- Geben Sie die Transfektionsmischung (in Tropfen verteilen) auf jede Platte (2,25 mL pro Platte). Die Platten vorsichtig schwenken und bei 3 % CO2, 37 °C über Nacht (16–20 h) inkubieren.
- Beobachte die Zellen. Sie sollten die Konfluenz erreichen. Wenn ein sichtbarer Marker (z. B. GFP) im Lentivektor-Plasmid vorhanden ist, kann die Transfektionseffizienz visuell beurteilt werden. Im Idealfall sollte die Transfektionseffizienz >90 % betragen.
- Das Medium entfernen, 15 ml frisches DMEM + 2 % FBS in jede Schale geben und auf 10 % CO2, 37 °C umfüllen. Über Nacht inkubieren.
- Erste Ernte des Überstands sammeln: Überstand (12 Schalen × 15 ml/Schale = 180 mL) aus den Schalen sammeln und poolen.
- Geben Sie 15 ml frisches DMEM + 2 % FBS in jede Schale. Die Schalen werden über Nacht bei 10 % CO2 , 37 °C inkubiert. Das Gefäß mit dem lentiviralen Überstand sollte in einen Sekundärbehälter gestellt werden (ein versiegelter Plastikbeutel reicht aus) und bei 4 °C gelagert werden.
- Konzentrieren Sie das Viruspräparat: Konzentrieren Sie die Viruspartikel durch Ultrazentrifugation. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 70.000 x g für 2 h bei 20 °C. Empfohlen werden konische Röhrchen (im Gegensatz zu Rundbodenröhrchen) und schwingende Schaufelrotoren (im Gegensatz zu Festwinkelrotoren) (einfach weil das fast unsichtbare Pellet durch diese Kombination leichter zu lokalisieren ist). Wir verwenden konische Röhrchen mit einem Beckman SW28 Rotor (Kapazität für sechs Röhrchen) bei 19.400 U/min für 2 h bei 20 °C. Füllen Sie die Röhrchen mit 30 mL Überstand. Das Gesamtvolumen des Überstands aus einer 12 × 15 cm großen Zubereitung beträgt 360 ml; Daher sind für die Verarbeitung des vollen Volumens zwei aufeinanderfolgende Drehungen erforderlich. Laden Sie die Röhrchen, machen Sie die erste Drehung, gießen Sie den Überstand aus, ohne das Pellet zu stören, laden Sie mit frischem Virusüberstand nach und führen Sie die zweite Drehung durch.
- Gießen Sie den Überstand ab und lassen Sie die restliche Flüssigkeit abtropfen, indem Sie die umgedrehten Röhrchen auf Küchenpapier legen. Saugen Sie die verbleibenden Tröpfchen mit einem Aspirator ab, um die gesamte Flüssigkeit aus dem Pellet zu entfernen. Das Pellet sollte als kleiner durchscheinender Fleck kaum sichtbar sein.
- Resuspendieren Sie die Viruspellets in 100 μl 1× HBSS. Vermeiden Sie Schaumbildung. Spülen Sie die Röhrchen mit 100 μl 1× HBSS. Fassen Sie beide Volumina zusammen, um ein Endvolumen von 200 μl zu erhalten.
- In ein Mikrofuge-Röhrchen mit Schraubverschluss umfüllen, in Parafilm einwickeln und bei niedriger Geschwindigkeit 15–30 Minuten lang vortexen. Das resuspendierte virale Präparat sieht von klar bis leicht milchig aus.
- Reinigen Sie die Suspension, indem Sie sich 10 s lang auf einer Tisch-Mikrozentrifuge drehen. Den Überstand in ein frisches Mikrofuge-Röhrchen mit Schraubverschluss umfüllen. Es werden 20 μl Aliquots des Überstands hergestellt. Dieser Virusüberstand ist von In-vitro-Qualität.
- Kultivierung von ca. 2,0 x 106 Zellen aus einer humanen Gliomzelllinie mit DMEM plus 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in einer 15-cm-Schale; oder Kultur von 2,0 x 106 humanen Glioblastom-Patientenkügelchen (GBM-PDX) mit DMEM/F12 1:1 Medium mit B27-Supplement plus humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF; 20 ng/ml) und FGF (10 ng/ml) in einem T75-Kolben.
- Halten Sie alle Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 und 100 % relativer Luftfeuchtigkeit.
- Dissoziieren Sie die Zellen.
- Für die Gliomzellen: Entfernen Sie den Überstand von den Platten und geben Sie 3-5 ml Trypsin 1X zu den Gliomzellen.
- Für die GBM-Kugeln: Sammeln Sie die Zellen, indem Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen pipettieren.
- Schleudern Sie die GBM-Kugeln bei 200 x g für 5 Minuten mit einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur herunter.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 3–5 ml Zellablösungslösung hinzu.
- Inkubieren Sie alle Zellen bei 37 °C für 10–15 Minuten.
- Dissoziieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren (stellen Sie sicher, dass die Kugeln und Gliomzellen vollständig dissoziiert sind) und schleudern Sie sie 5 Minuten lang bei 200 x g herunter.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 5 ml Medium, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Bestimmen Sie die Zellviabilität durch Trypanblau-Ausschluss.
- Platte 1,0 x 106 der Zielzellen in einer 10-cm-Schale mit 5 mL Medium durch Pipettieren.
- Zellen mit Lentiviren, die fluoreszierende Proteine exprimieren, bei Multiplicity of Infection (MOI) 5 transduzieren und bei 37 °C inkubieren.
- Nach 24 Stunden wird das Medium aus den transduzierten Zellen entfernt, 5 ml frisches Medium hinzugefügt und weitere 48 Stunden bei 37 °C inkubiert.
- Dissoziieren Sie die infizierten Zellen mit Trypsin in eine einzellige Suspension, wie oben beschrieben. Schleudern Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min herunter und resuspendieren Sie sie in 500 μl Sortierlösung (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1% FBS).
- Pipettieren Sie die Zellsuspension in FACS-Röhrchen. Co-Färbung der Zellen mit 1 μl/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-dihydrochlorid, um tote Zellen auszuschließen. Für die Einrichtung der Durchflusszytometer-Gates sind Negativkontrollen erforderlich (nicht transduzierte Zellen und nicht transduzierte Zellen/ DAPI-gefärbt).
- Sortieren Sie die fluoreszierenden/DAPI-negativen Zellen in Sortierlösung und sammeln Sie die sortierten Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
- Die sortierten Zellen werden 5 Minuten lang bei 200 x g heruntergeschleudert, der Überstand entfernt und in 5 ml Kulturmedium resuspendiert. Die sortierten Zellen durch Pipettieren in eine 10-cm-Schale aussäen. Bei 37 °C mindestens 48–72 h inkubieren.
- Erweitern Sie die sortierten Zellen, indem Sie die Zellen wie oben beschrieben dissoziieren und für In-vivo-Experimente in mehrere Schalen plattieren.