Migrationsassay für Hirntumor-Stammzellen (BTSC) für Arzneimittelbehandlungsstudien: Eine In-vitro-Lebendzell-Bildgebungstechnik zur Analyse der Wirkung einer medikamentösen Behandlung auf die Migration von BTSCs

Zusammenfassung

Quelle: Restall, I. et al. Lebendzell-Bildgebungsassays zur Untersuchung der Migration und Invasion von Glioblastom-Hirntumor-Stammzellen. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video führen wir einen Migrationsassay für Hirntumor-Stammzellen durch, um die Wirkung des interessierenden Medikaments auf die Migration von lebenden Hirntumor-Stammzellen mit Hilfe der Chemotaxis-Migrationsplatte zu analysieren. Die Bildgebung von lebenden Zellen erleichtert die Visualisierung und Quantifizierung der Zellmigration während des Assays.

Protokoll

>1. Migrationsassay für Hirntumor-Stammzellen

1. 200.000 Zellen in einem T25-Kolben in 8 ml vollständigem Medium 1–2 Wochen vor der geplanten Durchführung eines Migrationsassays aussäen.
   Anmerkung: Die Zeit zwischen dem Plattieren und der Durchführung des Assays hängt von der Wachstumsrate der verwendeten BTSC-Kultur ab.
   1. Um die Wirkung einer medikamentösen Behandlung auf die Migration zu testen, behandeln Sie die Zellen mit dem geeigneten Vehikel, wie z. B. DMSO, und dem Arzneimittel von Interesse, indem Sie die entsprechenden Volumina des Vehikels oder des Arzneimittelbestands direkt in separate Vertiefungen des Mediums geben, das die Zellen enthält.
2. Bereiten Sie die Chemotaxis-Migrationsplatte (Abbildung 1A) vor, indem Sie sie mit einer dünnen Schicht Kollagen beschichten.
   1. Berechnen Sie die Anzahl der Vertiefungen einer 96-Well-Chemotaxisplatte, die mit Kollagen beschichtet werden müssen. Fügen Sie für jede Bedingung mindestens drei Replikatvertiefungen hinzu.
   2. Verdünnen Sie 5 mg/ml Stamm von Kollagen Typ I auf 0,2 mg/ml in reiner Essigsäure, verdünnt auf 0,14 % in Wasser in Kulturqualität.
   3. Pipettieren Sie 0,2 mg/ml Kollagen sowohl in die Membraneinsatzvertiefungen als auch in die verwendeten Vertiefungen des unteren Reservoirs.
      Anmerkung: Die unteren Reservoirs der Platte benötigen 225 μl und die Vertiefungen der Membraneinsätze benötigen 75 μl Kollagen für eine ordnungsgemäße Beschichtung.
   4. Stellen Sie die Migrationsplatte für 1 h bei 37 °C in einen Inkubator. Saugen Sie die Kollagenlösung aus den Vertiefungen ab, ohne die Kollagenbeschichtung zu zerkratzen.
   5. Waschen Sie die Vertiefungen 2x mit sterilem 1x PBS. Wenn die Platte nicht sofort verwendet wird, aspirieren Sie das PBS und lagern Sie es bis zu 2 Wochen lang bei 4 °C. Erwärmen Sie die Chemotaxis-Migrationsplatte vor der Verwendung auf Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie das untere Reservoir der Chemotaxis-Migrationsplatte vor.
   1. Pipettieren Sie 225 μl Medium (ohne Wachstumsfaktoren), ergänzt mit 10% FBS als Chemolockstoff, in die unteren Reservoirvertiefungen der Chemotaxis-Migrationsplatte.
   2. Legen Sie den Membraneinsatz vorsichtig schräg in den unteren Behälter, um Blasenbildung zu vermeiden.
4. Platten Sie die Zellen in den Membraneinsatz der Chemotaxis-Migrationsplatte.
   1. Resuspendieren Sie dissoziierte BTSCs in Medien (ohne Wachstumsfaktoren) bei einer Zelldichte von 50.000 Zellen/ml. Fügen Sie den Medien Medikamente hinzu, wenn Sie die Migration während verschiedener medikamentöser Behandlungen bewerten. Alternativ wird die gleiche Anzahl vorbehandelter Zellen und Kontrollzellen ausgesät, wobei die endgültige Wirkstoffkonzentration beim Plattieren beibehalten wird.
   2. 50 μl der BTSC aus Schritt 1.4.1 unter den gewünschten Behandlungsbedingungen in jede Vertiefung der Migrationsplatte einfüllen.
5. Stellen Sie sich die Chemotaxis-Migration vor.
   1. Platzieren Sie die Chemotaxis-Migrationsplatte in das Lebendzell-Bildgebungssystem und stellen Sie die automatisierte Bildgebungssoftware so ein, dass sie alle 1–2 Stunden mikroskopische Bilder der Platte für bis zu 72 Stunden aufnimmt. Klicken Sie mit kommerzieller Software (siehe Materialtabelle) mit der rechten Maustaste auf die Zeitleiste und stellen Sie das Scan-Intervall für 24 Stunden auf alle 2 Stunden >ein<. Anmerkung: Das Zeitintervall und die insgesamt verstrichene Zeit variieren je nach verwendeter BTSC-Kultur. Beginnen Sie mit 2 h Intervallen für 72 h, bis Erfahrungen mit einzelnen BTSC-Kulturen gesammelt wurden. Wenn kein automatisiertes Bildgebungssystem verfügbar ist, können Bilder desselben Sichtfelds manuell mit einem Mikroskop und einer Kamera aufgenommen werden, die an die Bildgebungssoftware angeschlossen sind.
   2. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, erhalten Sie die Bilder für das gesamte Experiment und erstellen Sie mit der Analysesoftware, die Zellen vom Hintergrund der Membran und den Migrationsporen unterscheidet, eine Verarbeitungsdefinition (Abbildung 1B, rote Maske). Wählen Sie mit kommerzieller Software (siehe Materialtabelle) eine neue Verarbeitungsdefinition aus und setzen Sie die Einstellungen für die Verarbeitungsdefinition für BTSCs auf einen Seed-Schwellenwert von 52, einen Wachstumsschwellenwert von 85, eine Anpassung der Größe (Pixel) um -1 und eine Mindestfläche von 200 μm². Wenden Sie diese Verarbeitungsdefinition auf die Unterseite der Membran an. Ändern Sie diese Analyse, wenn sie Zellen nicht genau von der Hintergrundmembran unterscheidet.
   3. Sammeln Sie Daten als Zelloberfläche auf der Unterseite der Membran für jede der drei Replikationsvertiefungen, wobei nur die Zellen gezählt werden, die durch die Poren gewandert sind. Grafische Darstellung der Migration der Zellen in^{μm 2} (Fläche der migrierten Zellen) über die Zeit (Abbildung 1C).
      Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die relative Anzahl der Zellen, die zum ersten Zeitpunkt auf der Oberseite der Membran plattiert und gezählt werden, bei allen Behandlungsbedingungen ähnlich ist (weniger als 20 % Abweichung über alle Wells hinweg), um Auswirkungen einer ungleichmäßigen Beschichtung zu vermeiden. Die Datenerfassung mit der kommerziellen Software (siehe Materialtabelle) kann durchgeführt werden, indem Sie die in Schritt 1.5.2 erstellte Verarbeitungsdefinition starten, auf Metriken, dann auf Grafik/Export und dann auf Datenexport klicken.

Ergebnisse

Abbildung 1: Lebendzell-Imaging einer BTSC-Migration. (A) Dies ist ein Beispiel für eine 96-Well-Chemotaxis-Migrationsplatte, die vor der Durchführung des Migrationsassays mit BTSCs mit einer dünnen Schicht Typ-I-Kollagen beschichtet wurde. Die Bilder zeigen i) eine Platte, auf der alle drei Teile (Deckel, Membraneinsatz und Reservoir) zusammen platziert sind, ii)...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Matrigel-Matrize	Corning	Artikel-Nr.: 356230
96-Well-Platten	Eppendorf	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ThermoFisher	156367
Falcon 15 mL konisches Röhrchen	ThermoFisher	352096
Incucyte ClearView 96-Well-Chemotaxis-Platte	Essen Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 4582
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysesystem	Essen Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 4545
IncuCyte Zoom Software zur Analyse lebender Zellen	Essen Biowissenschaften	2016A Rev1
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma	Nr. D8537
Wasser in Kulturqualität	Lonza BioWhittaker	17-724Q
Fötales Rinderserum (FBS)	Invitrogen	Tel.: 12483-020
Ratten-Kollagen I	Trevigen	Artikel-Nr.: 3440-100-01
Accumax-Lösung zur Zellablösung	Innovative Zelltechnologien	AM105