>1. Assay zur Invasion von Hirntumor-Stammzellen in der Neurosphäre
- Keimen Sie 200.000 Zellen in 8 ml vollständigem Medium in einem T25-Kolben 1–2 Wochen, bevor Sie einen Invasionsassay planen.
Anmerkung: Der Zeitpunkt von der Beschichtung bis zur Durchführung des Assays hängt von der Proliferationsrate der verwendeten BTSC-Kultur ab.
- Bei vorbehandelten Zellen wird die interessierende Verbindung in der gewünschten Konzentration für den vorgegebenen Zeitverlauf in den Kolben gegeben, bevor die Neurosphären für die Invasion plattiert werden können.
- Warten Sie, bis die durchschnittliche Neurosphärengröße etwa 150–200 μm beträgt; in der Regel dauert dies 7–14 Tage, abhängig von der verwendeten BTSC-Kultur.
Anmerkung: Typisch ist es, eine Verteilung der Kugelgrößen im Kolben zu beobachten.
- Kippen und mischen Sie den Kolben vorsichtig mit einer Pipette und bewegen Sie 500 μl der BTSC-Neurosphären in ein konisches 1,5-ml-Röhrchen für jede Behandlungsbedingung. Dies wird verwendet, um drei Replikatvertiefungen zu plattieren.
HINWEIS: Die Schritte 1.3.1 bis 1.3.2 sind optional, werden aber für das erste Invasionsexperiment mit einer neuen BTSC-Kultur empfohlen.
- Um die Dichte der Neurosphären zu bestimmen, die in der Vertiefung landen, bereiten Sie ein 1,5-ml-Röhrchen wie in Schritt 1.3 vor. Mischen Sie die Neurosphären vorsichtig und geben Sie 100 μl in eine separate 96-Well-Platte und lassen Sie die Neurosphären 5 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen.
- Überprüfen Sie die Anzahl der Neurosphären unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich mehrere Neurosphären in dem Bereich der Vertiefung befinden, die abgebildet werden soll, ohne dass sie überfüllt ist.
Anmerkung: Eindringende Neurosphären benötigen genügend Platz, um ihren Durchmesser zu verdreifachen, ohne mit benachbarten Neurosphären zu interagieren. Die Anzahl der Neurosphären pro Vertiefung kann eingestellt werden, indem die Anzahl der Neurosphären pro Vertiefung gezählt und mehr oder weniger Neurosphären aus dem T25-Kolben in das konische 1,5-ml-Röhrchen in Schritt 1.3 gegeben werden.
- Legen Sie das konische 1,5-ml-Röhrchen mit den Zellen aus Schritt 1.3 auf Eis und führen Sie die Schritte 1.5–1.7 auf Eis durch.
- Lassen Sie die Neurosphären durch die Schwerkraft 5 Minuten lang auf dem Boden des konischen 1,5-ml-Röhrchens absetzen und kühlen Sie eine beschriftete 96-Well-Platte auf Eis vor.
- Resuspendieren Sie die Neurosphären im extrazellulären Matrixprotein.
- Bereiten Sie für jede Behandlungsbedingung 500 μl einer 0,4 mg/ml Typ-I-Kollagenlösung auf Eis vor: Fügen Sie 459 μl Medium (ohne Wachstumsfaktoren), 40 μl der 5 mg/ml-Kollagenstammlösung und 0,92 μl steriles 1N NaOH hinzu (Tabelle 1).
HINWEIS: Pro Behandlungsbedingung sind 500 μl der Kollagenlösung erforderlich: 100 μl für jede der drei Replikatvertiefungen und 200 μl Überschuss. Medikamentöse Behandlungen müssen hier in der gewünschten Endkonzentration zugegeben werden, abzüglich der Medienkomponente der Lösung. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Typ-I-Kollagen als extrazelluläres Matrixprotein; Es kann jedoch jedes extrazelluläre Matrixprotein getestet werden. Darüber hinaus können bei BTSC-Kulturen, die langsamere Invasionsraten aufweisen, Wachstumsfaktoren oder FBS in den Medien ergänzt werden, um die Invasionsrate zu erhöhen.
- Nachdem sich die Neurosphären aus Schritt 1.5 abgesetzt haben, aspirieren Sie so viel wie möglich von dem Medium, ohne das Neurosphären-Kügelchen zu verlieren, das sich am Boden abgesetzt hat. Die Neurosphären werden vorsichtig in 500 μl der in Schritt 1.6.1 hergestellten Kollagenlösung resuspendiert.
- Geben Sie 100 μl der Mischung aus Kollagen und Neurosphäre in drei replizierte Vertiefungen der 96-Well-Platte auf Eis. Lassen Sie die Neurosphären 5 Minuten lang auf dem Eis ruhen.
- Übertragen Sie die 96-Well-Platte für 5 Minuten in einen 37 °C-Inkubator, um die Kollagenpolymerisation zu ermöglichen.
- Bereiten Sie sofort das Abbild der 96-Well-Platte vor.
- Legen Sie die 96-Well-Platte in das Tablett eines Bildgebungssystems für lebende Zellen oder auf den Tisch eines Mikroskops, um ein Bild als Referenz für die Größe der Neurosphäre zum Zeitpunkt der Beschichtung aufzunehmen, bevor die Invasion beginnt.
- Erfassen Sie stündlich Bilder, bis die Invasionsrate ein Plateau erreicht hat; in der Regel geschieht dies innerhalb von 24 h.
Anmerkung: Das Bildgebungsintervall kann je nach verwendetem Gerät geändert werden. Das Bildgebungsintervall und die verstrichene Gesamtzeit können auch für BTSC-Kulturen mit unterschiedlichen Invasionsraten geändert werden.
- Bestimmen Sie die zunehmende Oberfläche von BTSCs, wenn sie im Laufe der Zeit in die Matrix eindringen.
Anmerkung: Die Oberfläche der Zellen zum Zeitpunkt der Beschichtung, berechnet als Mittelwert von drei replizierten Wells, muss zwischen den verschiedenen Behandlungsbedingungen ähnlich sein (weniger als 20 % Variation über alle Wells hinweg), um sicherzustellen, dass die Unterschiede in der BTSC-Invasion nicht stark durch die Anzahl oder Größe der plattierten Neurosphären beeinflusst werden.
- Verwenden Sie für das Lebendzellanalysesystem ein 10-faches Objektiv für die Bildaufnahme und nehmen Sie vier Bilder pro Vertiefung für die drei Replikationsvertiefungen auf. Um die relative Zelloberfläche zu bestimmen, die als prozentualer Zusammenfluss der Vertiefung dargestellt wird, richten Sie eine Verarbeitungsdefinition ein, die die Zellen speziell über dem Hintergrund der Vertiefung hervorhebt. Wählen Sie mit kommerzieller Software (siehe Materialtabelle) eine neue Verarbeitungsdefinition aus und setzen Sie die Segmentierungsanpassung auf 0,8, das Flächenminimum auf 300μm 2 und das Exzentrizitätsmaximum auf 0,99. Ändern Sie diese Analyse, wenn Zellen nicht genau vom Hintergrund unterschieden werden.
Anmerkung: Wenn Sie andere Methoden verwenden, um die Invasion der Neurosphäre im Laufe der Zeit abzubilden, wird empfohlen, mehrere Sichtfelder für die drei replizierten Vertiefungen im Zeitverlauf zu erhalten. Wenn jedoch nicht in jedem Intervall das exakt gleiche Sichtfeld abgebildet wird, erhöht sich der Standardfehler der erfassten Daten. Computersoftware kann verwendet werden, um die Oberfläche der eindringenden Zellen in jedem Bild zu messen.
- Erfassen Sie Daten als gesamte Zelloberfläche (entweder relativ oder absolut) für jede Vertiefung zu jedem Zeitpunkt und bestimmen Sie den Mittelwert der drei replizierten Vertiefungen. Stellen Sie die Invasion von BTSCs grafisch dar, indem Sie die zunehmende Zellfläche im Laufe der Zeit darstellen.
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| Zubereitung der Kollagenlösung |
| Bestand [Kollagen] (mg/ml) | 5 |
| Endgültiges [Kollagen] (mg/ml) | 0,4 |
| Anzahl der benötigten Vertiefungen: | 5 |
| Gesamtvolumen (μL) | 500 |
| Volumen des Stammkollagens (μL) | 40 |
| Volumen von 1N NaOH (μL) | 0,92 |
| Volumen des Mediums (μL) | 459 |
Tabelle 1: Herstellung der 0,4 mg/ml Typ I Kollagenlösung. Aufgeführt sind die bekannten Ausgangs- und gewünschten Endkonzentrationen der Kollagenlösung Typ I. Die aufgeführten Volumina reichen aus, um Neurosphären in drei replizierte Vertiefungen plus zwei für einen Überschuss zu pattieren, und können eine einzelne Behandlungsbedingung enthalten, wie in Protokollschritt 1 ausführlich beschrieben.
