Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung der gemusterten Folien
- Substratvorbereitung für die Mikrostrukturierung
- 18 mm kreisförmige Deckgläser 5 Min. durch Luft-/Plasmaaktivierung behandeln. Die Deckgläser in eine geschlossene Kammer mit 100 μl (3-Aminopropyl)-Triethoxysilan in einen Exsikkator für 1 h legen.
- Inkubieren Sie 1 h lang mit 100 mg/ml Poly(ethylenglykol)-succinimidylvalerat (Molekulargewicht 5.000 (Peg-SVA)) in 10 mM Karbonatpuffer, pH > 8. Ausgiebig mit Reinstwasser spülen und unter einer chemischen Haube trocknen.
Anmerkung: In diesem Stadium kann die Probe zur weiteren Verwendung bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.
- Geben Sie den Photoinitiator, 4-Benzoylbenzoyltrimethylammoniumchlorid (PLPP), in einer Menge von 14,7 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu.
Anmerkung: Eine konzentrierte Form von PLPP, ein PLPP-Gel, kann ebenfalls verwendet werden. Dies führt zu einer kürzeren UV-Beleuchtungszeit, die für den Abbau der PEG-Bürste erforderlich ist (100 mJ/mm2).
- Photoinitiator-Gelabscheidung
- Bereiten Sie eine Mischung aus 3 μl PLPP-Gel und 50 μl absolutem Ethanol vor, um sie in der Mitte des Objektträgers abzulagern. Die Probe wird unter eine chemische Haube gestellt, bis das absolute Ethanol vollständig verdampft ist.
Anmerkung: In diesem Stadium kann die Probe zur weiteren Verwendung bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.
- Glas-Objektträger-Mikrostrukturierung
- Montieren Sie das Deckglas in einer Ludin-Kammer und platzieren Sie es auf dem motorisierten Tisch eines Mikroskops, das mit einem Autofokus-System ausgestattet ist.
- Laden Sie Bilder, die den anvisierten Mikromustern entsprechen, in die Software. Wenden Sie diese Parameter an: 4 x 4-fache Replikation, Abstand von 200 μm, UV-Dosis von 1.000 mJ/mm2. Spülen Sie das PLPP nach der automatischen UV-Beleuchtungssequenz mit mehreren PBS-Wäschen ab.
Anmerkung: Wenn PLPP-Gel verwendet wurde, entfernen Sie es durch ausgiebiges Waschen mit deionisiertem Wasser, trocknen Sie es in einem Strahl von N2 und lagern Sie es bei 4 °C.
- 30 min mit Laminin (50 μg/ml in PBS) inkubieren. Ausgiebig mit PBS waschen.
HINWEIS: Eine fluoreszierende Lösung aus gereinigtem grün fluoreszierendem Protein (GFP, 10 μg/ml in PBS) kann mit Laminin gemischt werden, um die Mikromuster durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen.
>2. Vorbereitung von Neuronen und GBM-Zellen für die Co-Kultur
- Kultur embryonaler Hippocampus-Neuronen von Ratten
- Präparieren Sie den Hippocampus von embryonalen (E18) Ratten und übertragen Sie das Gewebe in eine Hank's balanced salt solution (HBSS)/1 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES)/Penicillin-Streptomycin-Lösung in einem 15 mL Röhrchen. Entfernen Sie überschüssige Lösung, ohne den Hippocampus zu trocknen.
- 5 ml Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) zugeben, ergänzt mit Penicillin (10.000 Einheiten/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) und 1 mM HEPES, und 15 min bei 37 °C inkubieren. 2x mit der HBSS/HEPES/Penicillin-Streptomycin-Lösung waschen und das Gewebe 2–3 Minuten in dieser Lösung verbleiben lassen.
- Dissoziieren Sie das Gewebe mit zwei flammpolierten Pasteur-Pipetten, indem Sie mit jedem Gewebe 10x auf und ab pipettieren und dabei darauf achten, dass die Schaumbildung minimiert wird. Zählen Sie die Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellsuspension. Plattieren Sie die Neuronen auf mikrostrukturierten Deckgläsern, wie unten gezeigt.
Anmerkung: Die Zellviabilitätsrate beträgt 85–90% nach der Extraktion.
- Zellkultur für Neuronen auf mikrostrukturierten Deckgläsern
- Rehydrieren Sie mikrostrukturierte Glasobjektträger mit PBS und inkubieren Sie das gesamte neuronale Zellkulturmedium.
- Die von E18 Sprague-Dawley-Ratten gewonnenen Hippocampus-Neuronen werden direkt über das mikrostrukturierte Glasdeckglas mit einer Dichte von 50.000 Zellen procm2 in neurobasalem Medium (NBM) ausgesät, das mit 3 % Pferdeserum angereichert ist. Legen Sie die mikrostrukturierten Neuronen für 48 h.
in den Inkubator (37 °C, 5% CO2)
Anmerkung: Nach ~6 h sind primäre Hippocampus-Neuronen zu sehen, die an den Laminin-Mikromustern haften.
- Co-Kultur von humanen GBM-Stammzellen auf Neuronen
- Während die kugelförmigen Zellen in Suspension wachsen, zentrifugieren Sie die Suspension 5 Minuten lang bei 200 × g. Waschen Sie die Sphäroide mit 5 mL PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 mL des Zelldissoziationsreagenzes (siehe Materialtabelle) für 5 min bei 37 °C.
- Fügen Sie 4,5 ml vollständiges NBM hinzu (ergänzt mit B27-Supplement, Heparin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2, Penicillin und Streptomycin, wie zuvor beschrieben) und zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zähltechnik.
- Säen Sie 1.000 GBM-Zellen über die mikrostrukturierte neuronale Kultur in NBM, angereichert mit 3 % Pferdeserum. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit.
