Isolierung und Kultivierung von primären Hirnperizyten: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Perizyten aus Rinderhirnkapillaren ohne Kontamination mit Endothelzellen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Hørlyck, S. et al. Kultur von Kapillarperizyten des Gehirns für zytosolische Calciummessungen und Calcium-Bildgebungsstudien.J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Perizyten aus Rinderhirnkapillaren ohne Kontamination mit Endothelzellen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Aussaat und Kultivierung von Rinderkapillaren

Tag 0: Mischen Sie 0,7 ml Kollagen-IV-Stamm mit 6,3 ml PBS. Geben Sie die Lösung in einen T75-Kolben und lassen Sie den Kolben 2 h bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 4 °C stehen.
Nehmen Sie die Kollagenlösung aus dem Kolben und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
Fügen Sie 7 ml Fibronektin-Arbeitslösung hinzu und lassen Sie den Kolben 30 Minuten lang bei RT. Entfernen Sie dann die Fibronektinlösung und säen Sie die Kapillaren unmittelbar danach aus.
Tauen Sie während der 30-minütigen Wartezeit ein Fläschchen mit Kapillaren in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
Wenn die Kapillaren aufgetaut sind, sofort mit 30 mL DMEM-comp in ein Zentrifugationsröhrchen umfüllen und 5 min bei 500 x g und RT zentrifugieren. DMEM-comp aus dem Röhrchen nehmen und das Kapillarpellet in 10 mL frischem DMEM-comp resuspendieren.
Die 10-ml-Suspension wird in den beschichteten T75-Kolben überführt und die Kapillaren 4–6 h lang in einem 37 °C-Inkubator bei 10 % CO₂,
Anmerkung: Die Zellwachstumsrate ist mit 10 % CO₂ höher als mit herkömmlichen 5 % CO₂.
Nach 4–6 Stunden Inkubation ist der Kolben unter einem Lichtmikroskop zu untersuchen. Fraktionen von Kapillaren sollten nun am Boden des Kolbens befestigt werden (Abbildung 1, Tag 0).
Bereiten Sie GM vor und saugen Sie das DMEN-comp Medium sehr vorsichtig aus den Kapillaren ab und ersetzen Sie es durch 10 mL frisch hergestelltes GM.
Tag 2: Entfernen Sie GM aus den Kapillaren und ersetzen Sie es durch 10 ml frisch hergestelltes GM. Das zelluläre Wachstum aus den Kapillaren sollte zu diesem Zeitpunkt unter einem Lichtmikroskop sichtbar sein (Abbildung 1, Tag 2–3).

>2. Isolierung von primären Perizyten aus Rinderhirnkapillaren

Tag 4: Untersuchen Sie die Kapillaren unter einem Lichtmikroskop.
Anmerkung: Der Kolben sollte nun zu etwa 60–70 % konfluent sein, um eine angemessene Menge an Perizyten bereitzustellen (Abbildung 1, Tag 4). Ist dies nicht der Fall; Ersetzen Sie den GM durch 10 ml frisches Medium und lassen Sie den Kolben für einen weiteren Tag im Inkubator.
Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen vorsichtig in PBS.
Fügen Sie 2 ml aufgetautes Trypsin-EDTA für Endothelzellen hinzu und lassen Sie den Kolben 1–3 Minuten im Inkubator. Nehmen Sie den Kolben häufig heraus und beobachten Sie ihn während dieser Zeit mit dem Mikroskop.
Anmerkung: Die Endothelzellen sollten sich aufrunden und vom Kolben lösen; Perizyten sollten als Zellen mit einer "Geister"-Morphologie sichtbar sein und dennoch an der Oberfläche des Kolbens haften, was ein kniffliger und wichtiger Schritt ist.Es ist wichtig, die meisten Endothelzellen zu entfernen, um eine Kontamination der Perizyten-Monokultur zu vermeiden, aber eine längere Trypsinisierung kann die Perizyten auch ablösen. Die Trypsinisierungszeit kann von Zeit zu Zeit leicht variieren, daher ist es von größter Bedeutung, den Kolben während der Behandlung häufig mit dem Mikroskop zu beobachten.
Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, wenn sich die Endothelzellen zu runden beginnen, um die gelösten Endothelzellen zu lösen.
Um die Trypsinisierung zu stoppen, geben Sie 10 ml DMEM-comp in den Kolben. Der Kolben wird einige Male vorsichtig mit dem Medium gespült, um die Endothelzellen zu entfernen. Die Endothelzellsuspension wird aus dem Kolben aspiriert. Die Endothelzellen können nun für andere Zwecke verwendet werden.
10 ml DMEM-comp werden in den Kolben gegeben. Schauen Sie unter das Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Perizyten noch vorhanden und am Boden befestigt sind. Setzen Sie den Kolben wieder in den Inkubator ein, damit die mit Perizyten angereicherte Kultur wachsen kann.
Anmerkung: Es ist wichtig, die Kultur in den folgenden Tagen zu beobachten. Wenn immer noch eine größere Anzahl von Endothelzellen wächst, kann eine weitere Trypsin-Behandlung durchgeführt werden.
Lassen Sie die Perizyten-Monokultur wachsen, indem Sie jeden zweiten Tag das DMEM-Comp.-Medium wechseln. Kontrollieren Sie das Wachstum der Zellen unter dem Lichtmikroskop (Abbildung 1, Tag 5–8).

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Kultivierung von Kapillaren und Isolierung von Perizyten.Die Kapillaren wurden aus frischem Rinderhirn isoliert und an Tag 0 in Kulturflaschen ausgesät. Das Auswachsen aus den Kapillaren des Rinderhirns und die anschließende Isolierung der Perizyten wurden über Tage hinweg mit einem Lichtmikroskop verfolgt. Tag 4a zeigt das Wachstum der Endothelzellen vor der Behandlung mit Trypsin zu...