Isolierung von Hirnkapillaren aus dem menschlichen Gehirn: Eine optimierte Methode zur Extraktion von Hirnkapillaren aus menschlichem Hirngewebe

Abstract

Quelle: Hartz, A. M. S. et al. Isolierung von Hirnkapillaren aus frischem menschlichem Hirngewebe. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Isolierung von Hirnkapillaren aus einem frischen menschlichen Gehirngewebe. Die isolierten Kapillaren können dann verwendet werden, um ein ex vivo Blut-Hirn-Schrankenmodell zu erstellen.

Protocol

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Vorbereitung von Gehirnproben

HINWEIS: Abbildung 1A zeigt das Workflow-Diagramm des gesamten unten beschriebenen Isolationsverfahrens. Menschliches Hirngewebe kann aus jedem Teil der Hirnrinde stammen und frisch oder gefroren verwendet werden. Gefrorenes Hirngewebe kann bei Raumtemperatur aufgetaut werden (kein Puffer; ~30 min für 10 g). Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, sollte das Hirngewebe bei jedem Experiment aus der gleichen Hirnregion gewonnen werden. Dieses Protokoll ist für frische (Post-Mortem Interval oder PMI <4 h) menschliche Großhirnrinde optimiert, die nicht eingefroren wurde.

1. Aufbereitung von menschlichem Hirngewebe: Dokumentieren Sie das Gewicht des Hirngewebes. Alle Zahlen im folgenden Protokoll sind für 10 g frisches menschliches Hirngewebe geeignet. Legen Sie das Hirngewebe in eine 100 mm Petrischale. Entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhäute mit einer Pinzette. Schneide mit einem Skalpell die weiße Substanz ab.
2. Zerkleinerung des menschlichen Hirngewebes: Schneiden Sie das Hirngewebe vorsichtig auf und hacken Sie es mit einem Skalpell auf. Ca. 5 min fein hacken (2–3 mm Stücke). Übertragen Sie das Hirngewebe in die Potter-Elvehjem-Gewebeschleifmaschine. Fügen Sie 30 ml Isolationspuffer hinzu.
   Anmerkung: Die zerkleinerten Gewebestücke sind schwer zu erkennen, da sich das Hirngewebe durch den Zerkleinerungsprozess in Brei verwandelt.

>2. Homogenisierung

1. Potter-Elvehjem Tissue-Zerkleinerer (Abstand: 150–230 μm): Homogenisieren Sie jede Probe mit 100 Hüben bei einer Homogenisatordrehzahl von 50 U/min. Dokumentieren Sie die Zeit alle 25 Striche und die Gesamtzeit, die für 100 Schläge benötigt wird. Siehe Tabelle 1 für ein vorgeschlagenes Homogenisierungsprotokoll; Die Gesamtzeit für die Homogenisierung von 10 g des menschlichen frontalen Kortex beträgt ca. 22 min. Rühren Sie nicht in Luft ein, um Blasen zu vermeiden.
2. Dounce Homogenisator (Clearance: 80–130 μm): Übertragen Sie das Homogenat auf Eis in einen Dounce Homogenisator. Homogenisieren Sie die Suspension mit 20 Hüben (~6 s/Hub, insgesamt ~2 min). Vermeiden Sie Blasen.

>3. Zentrifugation

1. Verteilen Sie das Gehirnhomogenat gleichmäßig auf vier 50-ml-Zentrifugationsröhrchen und dokumentieren Sie das Gesamtvolumen des Homogenats. 50 mL Dichtegradientenpuffer in die Zentrifugationsröhrchen verteilen (12,5 mL pro Röhrchen). Verwenden Sie 10 mL Isolationspuffer, um den Stößel und den Homogenisator zu spülen und in die vier Zentrifugationsröhrchen zu verteilen (~2,5 mL pro Röhrchen).
2. Die Zentrifugenröhrchen mit den Kappen fest verschließen. Homogenat, Dichtegradientenmedium und Puffer durch kräftiges Schütteln der Röhrchen mischen. Zentrifugieren bei 5.800 x g für 15 min bei 4 °C (Festwinkelrotor); Wählen Sie eine mittlere Verzögerungsgeschwindigkeit, um das Pellet am Rohr zu halten. Den Überstand verwerfen und jedes Pellet in 2 ml 1 % BSA resuspendieren.

>4. Filtration

HINWEIS: Um die Kapillaren von roten Blutkörperchen und anderen Zelltrümmern zu trennen, sind mehrere Filtrationsschritte erforderlich.

1. 300 μm Masche: Nach dem Resuspendieren des Pellets filtrieren Sie die Suspension durch das 300 μm Maschenweite. Kapillaren werden durch das Netz gefiltert, während größere Gefäße und größere Hirntrümmer auf dem Netz verbleiben. Waschen Sie das Netz vorsichtig mit bis zu 50 mL 1% BSA. Verwerfen Sie das Netz.
   Anmerkung: Dieser Filtrationsschritt befreit die Kapillarsuspension von größeren Gefäßen oder Brocken von Hirntrümmern.
2. 30 μM Zellstammfilter
   Anmerkung: Dieser Filtrationsschritt trennt die Kapillaren von den roten Blutkörperchen und anderen Hirntrümmern.
   1. Verteilen Sie das Kapillarfiltrat aus Schritt 4.1 auf die fünf 30 μm Zellstammfilter (ca. 10 mL Kapillarfiltrat pro Zellstammfilter). Kapillaren werden durch diesen Filter zurückgehalten, während rote Blutkörperchen, andere Einzelzellen und kleine Hirntrümmer den Filter passieren und im Filtrat gesammelt werden.
   2. Waschen Sie jeden Filter mit 25 ml 1 % BSA. Gießen Sie anschließend alle Filter über den sechsten Filter, um die Ausbeute zu erhöhen. Waschen Sie jeden Filter mit 50 mL 1 % BSA; Bewahren Sie die Zellstammfilter mit den Kapillaren auf und entsorgen Sie das Filtrat.

>5. Kapillar-Sammlung

1. Drehen Sie die Filter auf den Kopf und waschen Sie die Kapillaren mit 50 mL 1% BSA für jeden Filter in 50 mL Röhrchen. Üben Sie mit der Pipettenspitze einer 5-ml-Pipette vorsichtig Druck aus und bewegen Sie sie über den Filter, um die Gehirnkapillaren abzuwaschen.
2. Achten Sie darauf, alle Kapillaren des Gehirns abzuwaschen, insbesondere vom Rand des Filters. Vermeiden Sie Blasen, da dies den Filtrationsprozess erschwert und die Wahrscheinlichkeit von Kapillarverlusten erhöht.

>6. Waschen

1. Nach der Entnahme der Kapillaren zentrifugieren Sie alle Proben bei 1.500 x g für 3 min bei 4 °C (schwingender Schaufelrotor). Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut in ca. 3 ml Isolationspuffer. Kombinieren Sie alle resuspendierten Pellets aus einer Probe in einem konischen 15-ml-Röhrchen und füllen Sie es mit Isolationspuffer. Nochmals bei 1.500 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren und noch zwei Mal waschen.
2. Dokumentieren Sie die Kapillarreinheit mit einem Mikroskop (100-fache Vergrößerung) und einer Kamera (Abbildung 1B).
   Anmerkung: Die Kapillarausbeute des Gehirns aus 10 g menschlichem Hirngewebe beträgt in der Regel etwa 100 mg. Die isolierten Hirnkapillaren können nun für Experimente verwendet, verarbeitet (z. B. Lysat, Membranisolierung) oder schockgefroren und mindestens 6–12 Monate lang bei -80 °C in Kryoröhrchen gelagert werden (Vermeidung mehrerer Gefrier-Tau-Zyklen).

Schlaganfälle	Zeit
1–25	7–7,5
26–50	5–5,5
51–75	5–5,5
76–100	5–5,5
Gesamtzeit:	22–24 Minuten

Tabelle 1: Homogenisierungsprotokoll. Das Homogenisierungsprotokoll für die Potter-Elvehjem-Gewebemühle zur Homogenisierung von 10 g des menschlichen frontalen Kortex bei einer Homogenisierungsgeschwindigkeit von 50 U/min. Beachten Sie, dass die ersten Hübe zusätzliche Zeit benötigen, um das zerkleinerte Gewebe zu homogenisieren. Nach dieser anfänglichen Homogenisierung dauert jeder Hub 12 s (6 s für die Abwärtsbewegung, 6 s für die Aufwärtsbewegung). So können nach der anfänglichen Homogenisierung 5 Hübe in 1 min oder 25 Hübe in 5 min durchgeführt werden.

Results

Abbildung 1: Flussdiagramm für die Kapillarisolierung. (A) Das Piktogramm veranschaulicht die wichtigsten Schritte des Verfahrens zur Isolierung von Hirnkapillaren aus frischem menschlichem Gewebe. (B) Das Bild zeigt isolierte Kapillaren des menschlichen Gehirns unter einem Lichtmikroskop direkt nach der Isolierung (100-fache Vergrößerung).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Persönliche Schutzausrüstung (PSA)
Diamond Grip Plus Latex Handschuhe, Microflex Medium	VWR, Radnor, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 32916-636	Ppe
Einweg-Laborschutzkittel	VWR, Radnor, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 470146-214	PSA; aufgrund der Beschaffenheit des menschlichen Ausgangsmaterials wird die Verwendung eines Einweg-Laborkittels empfohlen
Gesichtsschutz, zum Einmalgebrauch	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	19460102	PSA; aufgrund der Art des menschlichen Ausgangsmaterials wird die Verwendung eines Einweg-Gesichtsschutzes empfohlen
Sicherheitsmaterialien
Clavies Hochtemperatur-Autoklavenbeutel 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 01-815-6
Versi Trockenbankpapier 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 14-206-32	Zur Abdeckung von Arbeitsbereichen
VWR Behältersysteme für scharfe Gegenstände	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 75800-272	Für gebrauchte Skalpelle
Bleichmittel 8,2 % Clorox, keimtötend 64 Unzen.	Versorgungszentrum in Großbritannien, Lexington, KY, USA	323775
Ausrüstung
4 °C Kühlschrank	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH-Messgerät	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	AB15
Heidolph RZR 2102 Steuerung	Heidolph, Elk Grove Village, IL, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Zentrifuge	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	75004521
Leica L2 Präpariermikroskop	Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove IL, USA		Wird verwendet, um Hirnhäute zu entfernen
POLYTRON PT2500 Homogenisator	Kinematica AG, Luzern, Schweiz	9158168
Spur P-403	Denver Instrument, Bohemia, NY, USA	191392
Standard Mini Stir	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	1151050
Thermo-Flaschen Flüssigstickstoff Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA	11-670-4C	Wird verwendet, um das Gewebe einzufrieren
Voyager Pro Analysenwaage	OHAUS, Parsippany, NJ, Vereinigte Staaten von Amerika	VP214CN
ZEISS Axiovert Mikrokope	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, Vereinigte Staaten von Amerika		Wird verwendet, um isolierte Kapillaren zu überprüfen
Werkzeuge und Glaswaren
Finnpipette II Pipette 1-5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 21377823T1	Waschen Sie die Kapillaren vom Filter ab
Finnpipette II Pipette 100-1.000 μL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 21377821T1	Pellet in BSA resuspendieren
Pipetten-Junge	Integra, Hudson, NH, Vereinigte Staaten von Amerika	739658
50 mL Falcon Röhrchen 25/Gestell - 500/cs	VWR, Radnor, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 21008-951
EISCO Skalpellklingen	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	S95938C	Um Hirngewebe zu zerkleinern
PARAFILM	VWR, Radnor, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 52858-000	Zum Abdecken von Becherglas und Messkolben
Thermo Scientific Finntip Pipettenspitzen 5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 21-377-304	Um die Kapillaren vom Filter abzuwaschen
60 mL Spritze mit Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	BD309653	Wird mit Verbindungsring zum Filtern von Kapillaren verwendet
Skalpell-Griff #4	Fine Science Tools, Foster City, Kalifornien, USA	Nr. 10060-13	Wird zum Zerkleinern verwendet
Dumont Pinzette #5	Fine Science Tools, Foster City, Kalifornien, USA	Nr. 11251-10	Wird verwendet, um Hirnhäute zu entfernen
Potter-Elvehjem Tissue-Mühle	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	3.43E+28	50 mL Volumen, Clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenisator	VWR, Radnor PA USA	Tel.: 62400-642	15 mL Volumen, Clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh-Gewebefilter (300 μm)	Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, Kalifornien, USA	146424	Wird verwendet, um die Kapillarsuspension zu filtern, um eventuell verbleibende Hirnhäute zu entfernen
pluriSiebe (Porengröße: 30 μm)	pluriSelect Life Science, Leipzig, Deutschland	Artikel-Nr.: 43-50030-03
Verbindungsring	pluriSelect Life Science, Leipzig, Deutschland	Artikel-Nr.: 41-50000-03	Mehrfach wiederverwenden
1 L Messkolben			Zur Vorbereitung von Isolationspuffer
1 L Becherglas			Zur Aufbereitung von 1% BSA
Rührstab			Zur Herstellung von 1% BSA und Ficoll®
Schott Flasche (60 mL)			Zur Zubereitung von Ficoll®
Eiskübel			Um alles kalt zu halten
100 mm Petrischale			Zum Zerkleinern von Hirngewebe
Gewebekultur-Zellschaber	VWR, Radnor, PA, Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 89260-222	So entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation
Chemikalien
BSA-Fraktion V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. A9647-500g	Bereiten Sie am Vortag in DPBS mit Ca2+ & Mg2+ vor. Vermeiden Sie Blasen bei der Zubereitung. Im Kühlschrank aufbewahren. Vor Gebrauch 10 Minuten langsam umrühren.
DPBS mit Ca2+ & Mg2+	Hyklon	SH30264.FS	DPBS - Teil des Isolationspuffers
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. F4375	Hier ist eine exakte Messung wichtig. In der Flasche mit Rührstäbchen abwiegen. Nach der Zugabe von DPBS kräftig schütteln. Im Kühlschrank aufbewahren O/N. Am Morgen wird es klar sein. Vor Gebrauch 10-15 Minuten vorsichtig umrühren. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren.
Glukose (D-(+) Dextrose)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. G7528	Glukose (D-(+) Dextrose) Konzentration: 5 mM
Natriumhydroxid-Standardlösung	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 71474	So stellen Sie den pH-Wert des DPBS
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. P2256	Konzentration: 1 mM