Fluoreszierende Peptid-Zymographie: Eine modifizierte Technik zum Nachweis der Proteaseaktivität unter Verwendung fluorogener Substrate in Zymogramm-Gelen

Zusammenfassung

Quelle: Deshmukh, A. A. et al. Nachweis der Proteaseaktivität durch fluoreszierende Peptidzymographie. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video führen wir Zymographie durch, eine elektrophoretische Technik, um die proteolytische Aktivität in biologischen Proben zu analysieren.

Protokoll

>1. Elektrophorese biologischer Proben in Peptid-Zymographie-Gelen

1. Die Proben werden in herkömmlichem Zymographie-Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25 % Glycerin, 4 % SDS, 0,01 % Bromphenolblau) gelöst. Für Zell- und Gewebeproben wird eine Gesamtproteinmenge von ~30 μg pro Vertiefung und eine Proteinmenge von 50–100 ng für MMP-Standards empfohlen.
2. Geben Sie 400 ml 1x Tris-Glycin SDS Running Buffer in das Gelgerät. Laden Sie bis zu 35 μl Probe pro Well. Lassen Sie die Proben 1,5 Stunden lang bei 120 V bei 4 °C laufen oder bis die Molekulargewichtsstandards anzeigen, dass sich die interessierenden Proteasen in der peptidauflösenden Gelschicht befinden (die eine sichtbare orange Farbe hat).
   Anmerkung: Die meisten MMPs und ihre Varianten liegen im Bereich von 35–100 kDa. Wenn die Molekulargewichtsstandards anzeigen, dass sich diese Gewichte innerhalb der peptidauflösenden Gelschicht befinden, kann die Elektrophorese gestoppt werden. Das gleiche Prinzip kann auf andere Klassen von Proteasen mit bekannten Molekulargewichten angewendet werden. Wenn ein Interesse an der Detektion mehrerer Proteasen über einen größeren Bereich von Molekulargewichten besteht, reduzieren Sie die Größe der auflösenden Gelschicht und erhöhen Sie die Größe der peptidauflösenden Gelschicht.
3. Nach der Elektrophorese nehmen Sie die Gele aus der Kunststoffkassette und waschen die Gele dreimal für jeweils 10 min bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in einem Renaturierungspuffer, der 2,5 % Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ und 5 mM CaCl₂ in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthält.
4. Übertragen Sie die Gele 15 Minuten lang in eine Entwicklungspufferlösung, die 1 % Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ und 5 mM CaCl₂ in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthält. Ersetzen Sie sie durch eine frische Entwicklungspufferlösung und inkubieren Sie die Gele 24 Stunden lang bei 37 °C unter leichtem Rühren, wobei Sie sicherstellen müssen, dass die Gele vollständig in die Lösung eingetaucht sind.
5. Nach 24 Stunden wird das Bild mit einem Fluoreszenz-Gel-Scanner/Imager unter Verwendung der entsprechenden Anregungs- und Emissionsfilter geliert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mm leere Gelkassetten	ThermoFisher Scientific	NC2015
20% SDS-Lösung	Ambion	AM9820
3x Zymographie-Probenpuffer	Bio-Rad	1610764
Azido-PEG3-Maleimid-Kit	Klicken Sie auf Chemiewerkzeuge	AZ107
PowerPac Basic Netzteil	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	Tel.: 161-0374
PrecisionGlide Injektionsnadeln	Fisher Scientific	Nr. 14-826