Fokus Ultraschallbasierte Mikroblasen-vermittelte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke: Eine Technik zur Erzeugung lokalisierter vorübergehender Öffnungen in der Blut-Hirn-Schranke von Mäusen durch Sonoporation

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Fokussiertes Ultraschallsystem

HINWEIS: Der beschriebene Aufbau ist ein selbst gebautes BBB-Störungssystem, das auf kommerziell erhältlichen Komponenten basiert und einen 3D-gedruckten, speziell angefertigten Kegel und eine abnehmbare stereotaktische Plattform enthält. Das System ist modular aufgebaut, was Modifikationen je nach verfügbarer Ausrüstung und spezifischer Verwendung ermöglicht. Das Protokoll beschreibt das Verfahren zur Sonoporation einer größeren Fläche in der pontinen Region des Mäusegehirns. Durch die Anpassung des Zielortes konnten verschiedene Teile des Gehirns gezielt angesprochen werden. In dieser Studie wurde ein 1 MHz Mono-Element-Schallkopf mit einer Brennweite von 75 mm, einer Apertur von 60 mm und einer Brennfläche von 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM des Spitzendrucks) verwendet. Die Brennebene des Schallkopfes wird durch den Schädel des Tieres in der horizontalen Ebene positioniert, die sich mit den Ohrstangen schneidet.

1. Wählen Sie einen geeigneten Schallkopf für die BHS-Öffnung bei Nagetieren.
   Anmerkung: Abhängig von den Eigenschaften der Mikrobläschen und der verwendeten Frequenz können sich die akustischen Einstellungen, insbesondere der mechanische Index (MI), ändern.
2. Platzieren Sie den Wandler in der 3D-gedruckten Membran.
3. Verwenden Sie eine akustisch transparente Mylar-Membran am unteren Ende des Kegels, um eine akustische Kopplung des Strahlausbreitungspfads zu erreichen, und füllen Sie den Kegel mit entgastem Wasser.
4. Montieren Sie den Schallkopf über dem Tier auf einem motorisierten Lineartisch, wie in Abbildung 1 gezeigt, und ermöglichen Sie so eine automatische vertikale Positionierung des Schallkopfes.
5. Entwerfen Sie eine abnehmbare stereotaktische Plattform basierend auf den Anforderungen der Studie, die temperaturregulierte Heizung, Biss- und Ohrriegel, Anästhesie und multimodale Passermarkenmarker umfasst, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigt. Die Halterung der stereotaktischen Plattform besteht aus einem 2D-Lineartischsystem, das eine präzise automatische Positionierung (< 0,1 mm) des Tieres unter dem Balken ermöglicht.
6. Verbinden Sie den Wandler mit der in Abbildung 1 gezeigten Schallemissionskette, die aus einem Wandler, einem Funktionsgenerator und einem Leistungsverstärker besteht.
7. Entwicklung einer Bildverarbeitungspipeline zur Erkennung der multimodalen Passermarkenmarker, die eine präzise Sonoporationsausrichtung des interessierenden Hirnbereichs und die Erfassung der vom Nadelhydrophon erfassten Kavitationsdaten ermöglichen.
8. Kalibrieren Sie das System und bestimmen Sie den Fokuspunkt des Schallkopfes in Übereinstimmung mit der vertikalen Positionierung des Tieres auf der stereotaktischen Plattform.

>2. Vorbereitung von Tieren

HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für Mäuse spezifiziert, kann aber für Ratten angepasst werden. Für diese Experimente wurden weibliche athyme nackte Foxn1-/- Mäuse (6–8 Wochen alt) verwendet.

1. Lassen Sie das Tier mindestens eine Woche lang in der Tieranlage akklimatisieren und wiegen Sie das Tier regelmäßig.
2. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg) durch subkutane (s.c.) Injektion 30 Minuten vor der FUS-Behandlung, um die analgetische Behandlung zu beginnen.
3. Betäuben Sie das Tier mit 3% Isofluran, 2 L/min O₂ und stellen Sie sicher, dass das Tier tief betäubt ist. Halten Sie die Tiere während des gesamten Eingriffs betäubt und überwachen Sie die Atemfrequenz und die Herzfrequenz, um die Isoflurankonzentration nach Bedarf anzupassen.
4. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um trockene Augen zu vermeiden und mögliche Verletzungen zu vermeiden.
5. Entfernen Sie die Haare auf dem Oberkopf mit einem Rasierer und einer Enthaarungscreme und waschen Sie sie anschließend mit Wasser, um Rückstände zu entfernen und Hautreizungen zu vermeiden.
6. Für Experimente mit BLI-Tumormodellen injizieren Sie 150 μl D-Luciferin (30 mg/ml) intraperitoneal (i.p.) mit einer 29-G-Insulinspritze zur BLI-Bildführung.
7. Legen Sie einen 26–30 g Schwanzvenenkatheter an und spülen Sie den Katheter und die Vene mit einer kleinen Menge Heparinlösung (5 IE/ml). Füllen Sie den Katheter mit Heparinlösung, um Blutgerinnsel zu vermeiden.
   Anmerkung: Eine gute Katheterisierung ist zu beobachten, wenn Blut in den Katheter zurückfließt. Vermeiden Sie Luftblasen im Katheter, um Embolien zu vermeiden. Um einen übermäßigen Injektionsdruck zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Länge des Katheters so kurz wie möglich ist.
8. Platzieren Sie das Tier auf der temperaturgeregelten stereotaktischen Plattform, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
   Anmerkung: Hypothermie reduziert die Durchblutung, was die Injektion/Zirkulation von Mikrobläschen und die Pharmakokinetik der Arzneimittel beeinträchtigen kann.
9. Den Kopf des Tieres mit Ohrstangen und einer Beißstange auf der stereotaktischen Plattform ruhigstellen und fixieren. Fixieren Sie den Körper mit einem Gurt und kleben Sie den Schwanz des Tieres an die Plattform.

>3. Bildgesteuerter fokussierter In-vivo-Ultraschall

HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde ein 1 MHz Monoelement-Wandler mit einem Ton-Burst-Impuls mit einer Dauer von 10 ms, einem MI von 0,4 und einer Impulswiederholfrequenz von 1,6 Hz mit 40 Zyklen für 240 s verwendet. Das Protokoll ist optimiert für Mikrobläschen, die durch Phospholipide stabilisiert werden, die Schwefelhexafluorid (SF₆) als harmloses Gas enthalten, wobei der mittlere Blasendurchmesser 2,5 μm beträgt und mehr als 90 % der Blasen kleiner als 8 μm sind.

1. Platzieren Sie die stereotaktische Plattform mit dem montierten Tier in der Bildgebungsmodalität (z. B. BLI oder Röntgen) und nehmen Sie Bilder des Tieres auf.
2. Verwenden Sie die multimodalen Passermarkenmarker in Kombination mit der Bildverarbeitungspipeline, um die Position des Tieres entsprechend dem Fokuspunkt des Schallkopfs zu markieren.
3. Bestimmen Sie das Zielgebiet, indem Sie einen Gehirnumriss über das aufgenommene Röntgenbild legen oder BLI-Bilder verwenden, um das Zentrum des Tumors zu bestimmen (Abbildung 2). Die Position bestimmter Teile des Gehirns wird im Paxinos Brain Atlas angegeben, wobei die Schädelmarkierungen Bregma und Lambda als Referenzpunkte verwendet werden. Zum Beispiel befindet sich der pons x=-1,0, y=-0,8 und z=-4,5 von lambda.
4. Schützen Sie die Nasenlöcher und das Maul des Tieres mit Klebeband, um zu verhindern, dass das Ultraschallgel die Atmung beeinträchtigt.
5. Tragen Sie Ultraschallgel auf den Kopf des Tieres auf.
6. Ziehen Sie die Haut am Hals der Tiere zurück, schmieren Sie das Nadelhydrophon mit Ultraschallgel und platzieren Sie das Nadelhydrophon in unmittelbarer Nähe des Hinterhauptbeins
.
7. Führen Sie den Schallkopf mithilfe der Bildverarbeitungspipeline und des Fokuspunkts in die richtige Position.
8. Wenden Sie die vorkonfigurierten Einstellungen auf alle angeschlossenen Geräte an und zielen Sie auf die gewünschte Gehirnregion ab.
   Anmerkung: Je nach Fragestellung können Tumor- oder Hirnregionen als einzelner Brennpunkt oder als volumetrische Form sonoporiert werden, wie in Abbildung 2 dargestellt.
9. Aktivieren Sie die Mikrobläschen wie vom Hersteller beschrieben. Injizieren Sie einen Bolus mit 120 μl (5,4 μg) Mikrobläschen.
10. Spülen Sie den Schwanzvenenkatheter mit Kochsalzlösung, um die Öffnung des Katheters zu überprüfen.
11. Injizieren Sie die Mikrobläschen und starten Sie die Insonation.
12. Nehmen Sie die Kavitation der Mikroblase mit dem Nadelhydrophon auf.
13. Verabreichen Sie nach der Sonoporation ein intravaskuläres Kontrastmittel oder Medikament. Die Dosis, der Zeitpunkt und die Planung hängen vom Zweck der Studie und dem Medikament ab.
    Anmerkung: Evans-Blau ist ein gängiges Farbmittel zur Beurteilung der BHS-Öffnung.
14. Überwachen Sie das Tier bis zum vorgegebenen Zeitpunkt oder vor dem humanen Endpunkt.

Abbildung 1: Fokussierter Ultraschallaufbau. (A) Schematische Darstellung des fokussierten Ultraschallaufbaus. (B) Bild des fokussierten Ultraschallaufbaus. Das System besteht aus einem von oben nach unten montierten Schallkopf auf einem 1D-Lineartisch über einem zweiten 2D-Tisch für die automatische 3D-Positionierung. Der Schallkopf ist in einem wassergefüllten Strahlkegel eingebaut, der unten mit einer akustisch transparenten Mylarmembran verschlossen ist, die den Schall zum Schädel des Tieres leitet. Der Wandler ist mit einem Leistungsverstärker verbunden, der wiederum zur Signalerzeugung mit einem Arbiträrsignalgenerator (AWG) verbunden ist. Zur Kavitationsdetektion wird ein abnehmbares Hydrophon in Kombination mit einem rauscharmen Spannungsverstärker verwendet. Das Hydrophon wird in unmittelbarer Nähe des Hinterhauptbeins platziert. Das externe Hydrophon hat eine aktive Oberfläche von 2 mm und ist akustisch mit Ultraschallgel gekoppelt. Sowohl das Hochspannungssignal des Anregungsimpulses als auch das aufgezeichnete Kavitationssignal werden von einem Standard-200-MHz-Oszilloskop digitalisiert und zur On-the-fly-Verarbeitung und Echtzeitsteuerung an einen Steuerrechner (nicht abgebildet) weitergeleitet.

Abbildung 2: Arbeitsablauf mit fokussiertem Ultraschall. Der vorgeschlagene Arbeitsablauf des fokussierten Ultraschallsystems beginnt mit (A) der anfänglichen Positionierung des Tieres auf einer abnehmbaren stereotaktischen Plattform, beachten Sie die Anwendung des akustischen Kopplungsgels (aufgetragen nach BLI/Röntgen). Gleichzeitig kann eine multimodale Bildgebung für das Targeting durchgeführt werden. (B) Zunächst ist die Röntgenbildgebung möglich, wobei mit Hilfe eines Umrisses des Gehirns (der wiederum auf den an die Größe und Haltung des Schädels angepassten Maushirnatlas40 verweist) eine Region von Interesse anvisiert werden kann. (C) Alternativ kann ein BLI-Bild eines Luciferase-transfizierten diffusen Mittelliniengliomtumors, das auf einer Röntgenprojektion mit maximaler Intensität überlagert ist, zur Zielbestimmung angewendet werden. (D) Anschließend wird die stereotaktische Plattform mit dem Tier in Therapieposition montiert, wobei sowohl das Hydrophon als auch der Schallkopf angebracht sind. Der Schallkopf fährt automatisch in die Therapieposition und beschallt die gewählte Trajektorie nach der Bolusinjektion. Das System ist für Hochdurchsatzexperimente optimiert, wobei mehrere Plattformen verschachteltes Arbeiten ermöglichen, wie oben gezeigt.