In utero Elektroporation basierte Genabgabe: Eine Technik zur Injektion von Plasmid-DNA in embryonale Kleinhirnzellen von Mausembryonen

Zusammenfassung

Quelle: Feng W. et al. CRISPR-vermittelte Analyse des Funktionsverlusts in Kleinhirn-Körnerzellen mittels In-utero-Elektroporations-basiertem Gentransfer. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Abgabe von Plasmid-DNA in zerebelläre neuronale Zellen von Mausembryonen mittels in utero-Elektroporation. Diese Methode ist nützlich, um die in vivo Funktion von Genen bei der normalen Gehirnentwicklung und die Veränderungen in der Genexpression von Neuronenzellen während der Tumorprogression zu verstehen.

Protokoll

1. In utero Elektroporation durchführen

1. Züchten Sie 6 bis 8 Wochen alte Mäuse und bereiten Sie die Werkzeuge für die In-utero-Elektroporation vor. Kreuzung männlicher homozygoter Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP-Mäuse mit weiblichen CD-1-Mäusen. Zeitpunkt der Trächtigkeit der CD-1-Mäuse ab dem Tag, an dem der Vaginalpfropfen erkannt wird (E0.5). Die Embryonen werden am Tag E13.5 elektroporiert.
   1. Ziehen Sie Kapillaren aus Borosilikatglas (Innendurchmesser: 0,6–0,8 mm) mit einem Mikropipettenabzieher. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: P = 500, Hitze = 560, Zug = 150, Vel = 75, Zeit = 250. Beschriften Sie die Kapillarspitze mit schwarzer Tinte, um sie während der Injektion besser sichtbar zu machen. Schneiden Sie die Kapillarverjüngung unter einem Stereomikroskop mit einem Lineal und einer scharfen Nadelpinzette ab und schneiden Sie die Spitze in einer Länge von ca. 6 mm ab.
   2. Bewahren Sie die Einheit der Kapillaren, um das Experiment reproduzierbar zu halten. Erstellen Sie während des Beschneidens eine einseitig abgeschrägte Kante. Die Spitze sollte so scharf wie möglich sein, um das Eindringen in die Gebärmutterwand zu erleichtern und Gewebeschäden am Embryo zu vermeiden.
      Anmerkung: Alternativ können Sie auch einen Mikroschleifer verwenden, um einen Winkel von 35° einzustellen. Die Kapillaren können bei Raumtemperatur in einer 10 cm Petrischale unter pathogenfreien Bedingungen gelagert werden.
   3. Autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente.
   4. Mischen Sie die sgRNA-Plasmide zu gleichen Teilen mit pT2K-IRES-Luc auf eine Endkonzentration von mindestens 1 μg/μL für jedes Plasmid und färben Sie die Plasmid-Lösung mit schnellgrün (Endkonzentration von 0,05%). Bereiten Sie 1% schnelle grüne Stammlösung mit endotoxinfreiem destilliertem Wasser vor und filtrieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter, um Farbstoffpartikel aus der Lösung zu entfernen.
      Anmerkung: Die Co-Transfektion von pT2K IRES-Luc ist optional, ermöglicht aber die Identifizierung lebensfähiger elektroporierter Tiere nach der Geburt mittels Biolumineszenz-Bildgebung. Bereiten Sie eine ausreichende Menge Plasmidmischung für die Gesamtzahl der zu operierenden trächtigen Mäuse vor. Verwenden Sie etwa 15–20 μl Mischung pro Maus (~12 Embryonen). Fahren Sie sofort mit der Operation fort.
2. Bereiten Sie Mäuse auf die Operation vor
   1. Betäuben Sie schwangere CD-1-Mäuse mit Isofluran. Induzieren Sie die Anästhesie in einer Box mit 3–4 Vol.-% Isofluran (Sauerstoffflussrate: 1,5 l/min) und halten Sie sie während der Operation über den Nasenkonus bei 2 Vol.
      Anmerkung: Die gesamte Operation sollte nicht länger als 30 Minuten dauern. Reduzieren Sie bei Bedarf die Anzahl der injizierten und elektroporierten Embryonen. Verwenden Sie sterile Handschuhe für die Operation.
   2. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Heizkissen und stellen Sie die Anästhesie ein.
   3. Injizieren Sie ein Analgetikum (Metamizol, 800 mg/kg Körpergewicht, subkutan (s.c.), 24 h Depot).
      Anmerkung: Sie können andere zugelassene Analgetika als Metamizol verwenden.
   4. Tragen Sie Augensalbe auf, um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern.
   5. Fixieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband und sterilisieren Sie den Bauch mit einem Desinfektionsmittel. Decken Sie die Maus mit Gaze ab, so dass nur der Operationsbereich freiliegt. Verteilen Sie 70% Ethanol auf das Operationsgebiet und die Gaze.
   6. Machen Sie einen Hautschnitt von ca. 2 cm Länge und erweitern Sie den Spalt vorsichtig mit einer geraden chirurgischen Schere. Lokalisieren Sie die Linea alba und machen Sie einen etwas kleineren zweiten Schnitt durch das Peritoneum mit einer Gewebeschere mit stumpfer Spitze.
   7. Befeuchten Sie die geöffnete Bauchhöhle mit vorgewärmtem sterilem 1x PBS.
   8. Ziehen Sie die Gebärmutterhörner vorsichtig mit einer Ringzange aus der Bauchhöhle. Ziehen Sie vorsichtig, indem Sie die Gebärmutterwand nur an der Lücke zwischen den Dottersäcken zweier benachbarter Embryonen greifen. Vermeiden Sie jeglichen Druck auf den Embryo, während Sie ihn durch den Schnitt ziehen. Vergrößern Sie den Schnitt bei Bedarf und achten Sie besonders darauf, die Gebärmutterhörner auf dem Bauch zu positionieren, ohne den Blutfluss durch die Gebärmutterarterie zu komprimieren.
      Anmerkung: In einigen Fällen wird empfohlen, jeweils ein Uterushorn zu extrahieren und zu ersetzen, bevor mit dem zweiten Uterushorn fortgefahren wird.
3. Injektion und Elektroporation von Plasmid-DNAs
   1. Aspirieren Sie ca. 15 μl farbige Plasmidlösung mit der vorbereiteten Glaskapillare. Vermeiden Sie während dieses Vorgangs Luftblasen.
      Anmerkung: Die Plasmidlösung kann die Spitze leicht verstopfen, wenn ihre Konzentration hoch ist. Testen Sie die Kapillare, indem Sie direkt vor der Injektion etwas DNA freisetzen.
   2. Halten Sie den Embryo vorsichtig mit einer Ringzange fest und lokalisieren Sie den Halsbereich.
      Anmerkung: Wenn sich der Embryo in einer Position befindet, in der es schwierig ist, ihn zu injizieren, überspringen Sie ihn und holen Sie sich den nächsten Embryo. Eine vermehrte Neupositionierung des Embryos kann die Wahrscheinlichkeit einer Beschädigung des Embryos erhöhen.
   3. Langsam mit der Spitze der zuvor präparierten Glaskapillare durch das Eindringen in das hintere Hinterhirn in den vierten Ventrikel stechen und anschließend etwa 1 μl des Plasmid-Mixes injizieren. Vergewissern Sie sich, dass die gefärbte DNA nicht aus dem Gehirn austritt und als rautenförmige Struktur sichtbar ist.
      Anmerkung: Verwenden Sie optional eine 2,5-fache Lupe zur besseren Visualisierung des vierten Ventrikels und der umliegenden Blutgefäße. Unmittelbar nach der Injektion werden elektrische Impulse abgegeben, um eine Diffusion der Plasmidlösung in die anderen Ventrikel zu verhindern.
   4. Elektrische Rechteckimpulse (5 Impulse, 32 mV, 50 ms-an, 950 ms-aus) mit einer zangenähnlichen Platinpinzette anlegen (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie die Elektroden seitlich, wobei der Minuspol das Ohr bedeckt und der Pluspol am Kleinhirnprimordium über der Gebärmutterwand positioniert ist. Verwenden Sie Elektrodenplatten mit einem Durchmesser von 5 mm für eine effektive Elektroporation von E13,5-Embryonen.
      Anmerkung: Erhöhen Sie die Überlebensrate von Jungtieren, indem Sie weniger als 2/^{3 der Gesamtzahl} der Embryonen pro Muttertier manipulieren. Vermeiden Sie Embryonen, die zu nahe am Gebärmutterhals liegen. Wenn sie manipuliert werden, können sie während der Wehen Komplikationen verursachen und den gesamten Wurf gefährden. Wenn sich die Elektroden zu nahe am Herzen des Embryos befinden, kann dies zu einem Herzstillstand führen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Autoklav-Band	Kisker Biotech	150262
Elektro Quadratischer Porator	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	Artikel-Nr.: 12362
Ethanol	Merck	107017
Augensalbe (Bepanthen)	Bayer	81552983
Schnelles Grün	Merck	104022
Filter (0,22 μm)	Merck	Nr. F8148
Pinzette gerade	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	91150-20
Gaze (X100 ES-Pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientific	15387311
Glaskapillare mit Filament	Narishige	GD1-2
heizkissen	ThermoLux	463265 / -67
Isofluran	Zoetis	TU061219
Ringzange	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 11103-09
stereomikroskop	Nikon	C-PS
Chirurgische Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 91460-11
Chirurgische Schere mit stumpfer Spitze	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14072-10
Pinzette mit 5mm- Scheibenelektroden Platin	Xceltis GmbH	CUY650P5
Metamizol	Wdt
Unsteriler Seidennahtfaden (0,12 mm)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 18020-50
PBS (1x)	Lebenstechnologien	14190169
Gewebeschere Blunt (11,5 cm)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14072-10
pCAG-EGxxFP	Addgene	Artikel-Nr.: 50716
pX330 Plasmid	Addgene	Artikel-Nr.: 42230