Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung der Mäuse und Operation
HINWEIS: In dieser Studie wurden 8 Wochen alte, männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Operationsbedingungen richten sich nach den IACUC-Regeln unserer Einrichtung. Die Instrumente werden sterilisiert, die chirurgische Arbeitsfläche wird desinfiziert, das Tier wird desinfiziert und der Chirurg trägt sterile Handschuhe.
- Am Tag vor der Operation betäuben Sie die Maus mit 2% Isofluran und entfernen Sie dann das Fell entlang der Länge des Oberschenkelknochens auf der dorsalen Seite entweder mit einem dünnen Rasiermesser oder einem chemischen Haarentfernungsmittel.
- Am Tag der Operation betäuben Sie die Mäuse mit 2% Isofluoran in einer Induktionskammer. Bestätigen Sie die Betäubung durch einen Zehenkneifreiz und eine ausbleibende Reaktion.
- Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
- Platzieren Sie die betäubte Maus auf der Bauchseite und sichern Sie jedes Glied vorsichtig mit hypoallergenem Klebeband, um eine leichte Spannung in der zu injizierenden Gliedmaße zu erzeugen. Die Anästhesie wird mit Isofluran aufrechterhalten, das über einen Präzisionsvaporizer und einen Nasenkonus verabreicht wird.
- Reinigen Sie die Injektionsstelle mit Betadine, dann erneut mit 70% Alkohol. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei Mal. Achten Sie darauf, dass keine losen Haare auf dem Operationsfeld zurückbleiben.
- Machen Sie mit einer kleinen Schere etwa 2 mm unterhalb und parallel zum Oberschenkelknochen einen 1 cm langen Schnitt. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette seitlich zurück, um die darunter liegenden Muskeln freizulegen.
- Der Ischiasnerv verläuft tief in die Musculus gluteus maximus und den Musculus biceps femoris. Trennen Sie diese beiden Muskeln entlang einer Faszienebene mit einer kleinen Schere und legen Sie den darunter liegenden Ischiasnerv frei. Befreien Sie den Nerv von den umgebenden Muskeln durch stumpfe Dissektion.
- Ziehen Sie 3 μl Krebszellen (ca. 50.000 Zellen) aus dem Pellet in eine 10 μl Spritze.
Anmerkung: Alternativ können Sie 3 μl PBS als Kontrolle ziehen.
- Legen Sie einen kleinen Metallspatel unter den Nerv an der Injektionsstelle, um ihn zu stützen. Führen Sie die Nadel unter Visualisierung mit einem Präpariermikroskop in den Nerv gegen die Metallbasis ein, wobei Sie die Nadel beim Einführen so parallel wie möglich zum Nerv halten. Achte darauf, dass du nicht durch den hinteren Teil des Nervs sticht. Minimieren Sie den Umgang mit dem Nerv während dieses Prozesses so weit wie möglich.
- Langsam über 5 s in den Nerv injizieren. Die Bildung einer Kugel im Injektionsbereich deutet auf eine gute Injektion hin. Lassen Sie dann die Nadel 3 s lang an Ort und Stelle, bevor Sie die Nadel vorsichtig entfernen. Wenn Sie die Nadel 3 s lang an Ort und Stelle halten, wird der Rückfluss der Zellen aus dem Nerv minimiert.
Anmerkung: Die Injektion kann in Richtung des distalen Nervs oder des Rückenmarks erfolgen. Es ist wichtig, innerhalb einer Reihe von Experimenten konsistent zu bleiben. Wenn die Zellen nach draußen gelangen, sollte das Tier nicht in die Analyse des Versuchs einbezogen werden. Erfahrungsgemäß sind diese Ereignisse sehr selten.
- Bringen Sie den Nerv wieder in seine ursprüngliche Position. Bedecke den Nerv mit den darüber liegenden Muskeln. Behandeln Sie die Mäuse mit der richtigen Analgesie und verschließen Sie die Haut dann mit 5-0 Nylonnähten.
- Setzen Sie die Maus allein in einen sauberen Käfig, um sie während der Genesung zu beobachten, bis sie vollständig aus der Narkose erwacht ist.
Anmerkung: Es dauert 5-15 Minuten, bis das Tier wieder bei vollem Bewusstsein ist. Das Tier wird nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Das Tier wird erst dann wieder in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, wenn es vollständig genesen ist. Bewerten Sie danach die Erholung mindestens einmal alle 24 Stunden für 72 Stunden.
