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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Extraktion des Ischiasnervs
- Man nehme Mäuse, deren Ischiasnerven zuvor mit Krebszellen injiziert wurden, und euthanasiere sie mit CO2. Platzieren Sie die Maus auf der Bauchseite und stabilisieren Sie die distalen Gliedmaßen mit Stiften.
- Entfernen Sie die Haut auf der dorsalen Seite der injizierten Gliedmaße und des injizierten Rumpfes.
- Mit einer stumpfen Dissektion legen Sie den Ischiasnerv tief in die Muskeln hinein.
- Der Nerv verläuft zwischen dem Darmbein und dem Kreuzbein. Um Zugang zum Nerv im Rückenmarksbereich zu erhalten, trennen Sie die beiden Knochen. Führen Sie zuerst eine geschlossene Schere in den schmalen Bereich ein, an dem sich der Ischiasnerv befindet, und öffnen Sie dann die Schere, während Sie die Maus halten. Seien Sie vorsichtig und bewahren Sie die Integrität des Ischiasnervs während der Dissektion.
- Präparieren Sie den Ischiasnerv vorsichtig distal bis zum Ende des Oberschenkelknochens und proximal zum Rückenmark.
Anmerkung: Eingedrungene Nerven sind extrem fragil und neigen dazu, unter Spannung oder gewaltsamer Handhabung zu brechen.
- Entferne den Nerv, indem du zuerst sein distales Ende durchschneidest. Hebe den Nerv vorsichtig an und befreie ihn dabei von angrenzendem Gewebe. Schneiden Sie den Nerv am proximalen Ende, so nah wie möglich an seinem Ausgang aus der Wirbelsäule.
- Notieren Sie dann die Bruttolänge der Invasion mit einem Messschieber. Diese makroskopische Schätzung ist nur indikativ.
>2. Nervenverarbeitung und Quantifizierung
- Betten Sie den präparierten Nerv in die OCT-Verbindung ein. Achten Sie darauf, die Nerven in Längsrichtung und so flach wie möglich auf dem Boden der Form zu platzieren.
- Geben Sie auf der Kassette die proximale und distale Seite des Nervs an, indem Sie die Buchstaben P (proximal) und D (distal) markieren.
- Legen Sie eingebettete Nerven auf Trockeneis, wenn sie nicht sofort geschnitten werden. Die Probe konnte mehrere Wochen lang bei -80 °C aufbewahrt werden.
- Schneiden Sie Proben mit einem Kryostat-Mikrotom mit einer Dicke von 5 μm und platzieren Sie die Schnitte auf Objektträgern. Wenn möglich, passen Sie zwei Nervenabschnitte pro Folie an. Geben Sie die proximale Seite des Nervs an.
- Färben Sie Objektträger mit H&E-Färbung.
- Scannen Sie gefärbte Nervenabschnitte digital mit einem Dia-Scanner, der hochauflösende digitale Daten liefert.
- Quantifizieren Sie mithilfe von Bildgebungssoftware die Länge der Invasion, indem Sie auf die Schaltfläche "Entfernung messen", den Invasionsbereich oder andere gewünschte Parameter klicken. Für eine gute Abschätzung der Dauer der Invasion verwenden Sie mehrere Abschnitte (2 bis 4) desselben Nervs.