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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Mäuse für die Injektion von Tumorzellen vorbereiten
- Betäuben Sie eine Maus durch intraperitoneale (i.p.) Injektion eines Ketamin/Xylazin-Cocktails (Ketamin 100 mg/kg, Xylazin 10 mg/kg).
- Bestätigen Sie die vollständige Anästhesie, indem Sie die Füße des Tieres kneifen und beobachten Sie ein ausbleibendes Ansprechen.
- Legen Sie die Maus auf eine Glasplatte (die zum Gießen von Proteingelen verwendet wird) und befestigen Sie sie mit Gummibändern.
- Entfernen Sie bei Bedarf die Nackenhaare, indem Sie sich rasieren oder eine kleine Menge Haarentfernungsmittel auftragen und die Haare mit einem Papiertuch abwischen.
Anmerkung: Wenn Sie nackte Mäuse verwenden, überspringen Sie diesen Schritt, da sie keine Körperbehaarung haben.
- Reinigen Sie die Halshaut durch Auftragen von Povidon-Jod und 70% Alkohol.
- Platzieren Sie die Maus auf dem Tisch des Präpariermikroskops
- Machen Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen ~1 cm langen Schnitt in die Haut.
- Präparieren Sie den Muskel stumpf mit einer Zahnzange, um die darunter liegende Halsschlagader freizulegen.
- Trennen Sie die Halsschlagader mit einer chirurgischen Zange vom angrenzenden Vagusnerv.
- Trennen Sie mit einer chirurgischen Zange etwas Watte von einem Wattebausch, befeuchten Sie ihn und formen Sie ihn zu einem kleineren Wattebausch. Legen Sie diesen mit Puffer befeuchteten Wattebausch unter die Halsschlagader der vorgesehenen Injektionsstelle.
- Legen Sie eine Naht distal und proximal zum Wattebausch an und machen Sie lockere Knoten. Ziehen Sie den proximalen Knoten fest, um den Blutfluss in die Injektionsstelle zu blockieren.
- Fahren Sie mit der Injektion von Krebszellen fort, wenn die Halsschlagader auf dem Wattebausch vollständig mit frischem rotem Blut unter Druck zu stehen scheint.
>2. Injektion von Krebszellen in die Halsschlagader
- Vortexen und ziehen Sie 100 μl Krebszellen in die Spritze.
- Führen Sie unter dem Präpariermikroskop die 31G-Nadel (mit Abschrägung nach oben) langsam in das Lumen der Halsschlagader ein, die auf dem Wattebausch sitzt.
- Injizieren Sie die Zellen aus der Spritze langsam in die Halsschlagader. Eine erfolgreiche Injektion kann unter dem Mikroskop an der sich ändernden Farbe der nahe gelegenen Blutgefäße und der Muskulatur beobachtet werden, wenn gepufferte Krebszellen in den Blutkreislauf geschoben werden.
- Wenn die Injektion des gesamten Volumens abgeschlossen ist, heben Sie die distale Halsschlagader vorsichtig an, um ein Aufstoßen zu verhindern.
- Ziehen Sie den distalen Knoten schnell fest, um den Injektionsvorgang abzuschließen.
- Nach Abschluss der Injektion ziehen Sie die Ligaturen fest und schneiden die überschüssige Seidennaht mit einer Mikroschere unter dem Präpariermikroskop ab. Bewegen Sie den abgetrennten Muskel zurück, um die Wundstelle zu bedecken. Verschließen Sie die Haut mit zwei Klammern.
>3. Chirurgische Genesung
- Bringen Sie das operierte Tier zur Genesung auf ein Heizkissen. Es kann 30–60 Minuten dauern, bis die Tiere wieder zu Bewusstsein kommen. In der Zwischenzeit ist Buprenorphin (0,05 mg/kg) über subkutane Injektion als postoperative Analgesie zu verabreichen.
Anmerkung: Die Analgesie sollte gemäß Ihrem lokalen, von der IACUC genehmigten Protokoll durchgeführt werden.
- Sobald die Tiere erwachen und ihr normales Verhalten wieder aufnehmen, bringe die Mäuse zu ihrem Wohnort zurück. Versorgen Sie Mäuse mehrere Tage nach der Operation mit Gelfutter. Führen Sie ein chirurgisches Protokoll und bewahren Sie es im Raum auf.
>4. Nicht-invasive In-vivo-Bildgebung
- Messen Sie bei Zellen, die mit Luciferase-Reporterkonstrukten markiert wurden, die Effizienz der Injektion von Krebszellen mit einem In-vivo-Bildgebungssystem.
Anmerkung: Die Bildgebung wird am Tag der Injektion nicht durchgeführt, um übermäßigen Stress für die Versuchstiere zu vermeiden.