Orthotope Langzeittransplantation von Tumorzellen in Zebrafischembryonen: Eine effiziente Methode zur Verlagerung von Tumorzellen in den vierten Ventrikel von Zebrafischembryonen zur Langzeitanalyse des Verhaltens von Tumorzellen

Zusammenfassung

Quelle: Casey, M. J. et al. Transplantation von pädiatrischen Zebrafisch-Hirntumoren in immunkompetente Wirte zur Langzeituntersuchung des Verhaltens von Tumorzellen und des Ansprechens auf Medikamente.J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die orthotope Transplantation von Zebrafisch-Hirntumorzellen in den vierten Ventrikel eines immunkompetenten Zebrafischembryos. Dieses Verfahren ermöglicht die Langzeituntersuchung der Invasion und des Verhaltens von Tumorzellen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Injektion der Tumorsuspension in den vierten Ventrikel eines 2-dpf Embryos

1. 10–20 anästhesierte dechorionierte Embryonen werden mit einer Transferpipette an die Peripherie der Injektionsplatte übertragen; die Embryonen sollten seitlich auf die Injektionsplatte fallen, wobei die Ventrikel deutlich sichtbar und zugänglich sind. Verwenden Sie eine abgewinkelte Sonde, um die Embryonen nach Bedarf anzupassen, und positionieren Sie sie vom äußeren Rand der Injektionsplatte weg.
2. Laden Sie 1–2 μl der Tumorzellsuspension mit den Pipettenspitzen der Gelladenadel in die Injektionsnadel und führen Sie die Nadel in den Manipulator ein.
3. Senken Sie den Manipulator manuell ab und halten Sie die Nadel in einem Winkel von 45°. Stellen Sie die Knöpfe am Mikromanipulator in x-, y- und z-Richtung ein, bis sich die Nadel knapp über und etwa 5 mm rechts vom Embryokopf befindet. Schauen Sie durch die Okulare des Stereomikroskops und stellen Sie den Mikromanipulator langsam in x-Richtung ein, bis die Nadel den vierten Ventrikel des Embryos durchsticht. Lassen Sie die Nadel nicht das Herz oder das Eigelb durchstechen.
   1. Drücken Sie das Fußpedal, das am Mikroinjektor befestigt ist, um die Tumorzellsuspension zu injizieren.
      Anmerkung: Der Einspritzdruck und die Einspritzzeit variieren je nach Größe der Nadelbohrung, aber ein guter Ausgangspunkt ist 5–10 PSI und 50–100 ms. Das Volumen der injizierten Tumorzellen kann auf Wunsch mit Standard-Öltropfentechniken durch Injektion in Mineralöl bestimmt werden. Injektionen von 500 pL mit einem Tropfendurchmesser von 0,1 mm führen in der Regel zu den besten Ergebnissen.
4. Spülen Sie die injizierten Embryonen vorsichtig von der Injektionsplatte in eine Petrischale mit frischem Eiwasser (0,6 g/l Aquariensalz in Umkehrosmosewasser + 0,01 mg/l Methylenblau). Bewahren Sie die Embryonen für die restlichen Eingriffe oder bis zur Aufzucht in Tanks in Eiwasser auf.
5. Untersuchen Sie die injizierten Embryonen unter einem Fluoreszenzstereomikroskop. Vergewissern Sie sich, dass der Injektionsdruck, der Winkel, die Nadelgröße und die Viskosität der Zellsuspension dazu führen, dass die Tumorzellen 25–50 % des Ventrikelraums ausfüllen. Passen Sie diese Parameter nach Bedarf an.
6. Wiederholen Sie die Schritte 1.1–1.5 für alle verbleibenden Embryonen. Betäuben Sie die zusätzlichen Embryonen nach Bedarf.
   Anmerkung: Ein erfahrener Anwender kann bis zu 300 Embryonen über einen Zeitraum von 3-4 Stunden injizieren.
7. Legen Sie die Embryonen über Nacht wieder in den 28°C heißen Inkubator.
8. Am nächsten Tag beurteilen Sie das Überleben des Embryos, indem Sie morphologische und physiologische Merkmale wie die normale Herz- und Gehirnentwicklung, wie beschrieben, untersuchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ei-Wasser	Im Haus		Embryonen erhalten, Injektionsplatte herstellen
Petrischale	Thermo Fischer	FB0875711Z	Unterbringung von Embryonen, Herstellung von Injektionsplatten
Glasbehälter	Jede Handelsmarke		Herstellung einer Injektionsplatte
Mikropipetten	Jede Handelsmarke		Tumorresuspension und -transplantation
Abgewinkelte Sonde	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 10140-02	Manipulation von Embryonen
Pipette übertragen	Jede Handelsmarke		Manipulation von Embryonen
stereomikroskop	Olymp	SZ61	Tumortransplantation
Fluoreszierendes Stereomikroskop	Olymp	SZX16	Bildgebung von Tumortransplantaten
Mikroskop-Kamera	Olymp	DP-72	Bildgebung von Tumortransplantaten
Brutkasten	Jede Handelsmarke		Konservierung der Embryonen, Aufwärmen der Injektionsplatte
N2	Jede Handelsmarke		Für die Einrichtung des Mikroinjektors
Glaskapillare (kein Filament)	Welt Präzisionsinstrumente	TW120-4	Tumortransplantation
Nadelabzieher	Sutter Instrumente	P-97	Tumortransplantation
Microloader-Tipps	Eppendorf	930001007	Tumortransplantation
Mikroinjektor	Harvard-Apparatur	PLI-90	Tumortransplantation
Tricain-S (MS-222)	Western Chemical	TRS1	Tumortransplantation, Anästhesie
Agarose	Denville	CA3510-8	Herstellung einer Injektionsplatte
Mikrowelle	Jede Handelsmarke		Herstellung einer Injektionsplatte
Maßstab	Jede Handelsmarke		Herstellung einer Injektionsplatte
Handschuhe	Jede Handelsmarke		Alle Aspekte des Protokolls
Pronase	Roche Diagnostik	11459643001	Dechorionate Embryonen
Rasierklinge	Thermo Fischer	Artikel-Nr.: 12640	Vorbereitung der Nadel
50 mL Becherglas (2 Zoll Durchmesser)	Jede Handelsmarke		Herstellung einer Injektionsplatte
Glasbehälter	Jede Handelsmarke		Herstellung einer Injektionsplatte
Methylenblau	Sigma-Aldrich	M9140	Zum Eiwasser hinzufügen, um Pilzwachstum zu verhindern