Intranasale Verabreichung von therapeutischen neuralen Stammzellen (NSCs) im Mausmodell: Ein Verfahren zur tumorgezielten Verabreichung von onkolytischen, virusbeladenen NSCs in ein Hirntumor-tragendes Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Yu, D. et al. Intranasale Verabreichung von therapeutischen Stammzellen an ein Glioblastom in einem Mausmodell. J. Vis. Exp.(2017)

Dieses Video zeigt die intranasale Verabreichung von onkolytischen, mit Viren beladenen therapeutischen neuralen Stammzellen in ein Hirntumor-tragendes Mausmodell. Die nicht-invasive intranasale Verabreichung von Stammzellen umgeht die Blut-Hirn-Schranke und erleichtert so deren Abgabe an die Tumorstelle im Gehirn für therapeutische Anwendungen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Hypoxische Präkonditionierung menschlicher NSCs (Abbildung 1A)

1. Plattenkultivierte NSCs in T75-Kulturflaschen, bis eine Konfluenz von 90 % erreicht ist.
2. Stellen Sie Zellkulturflaschen in eine befeuchtete CO_{2 -}Kammer/einen Inkubator mit einem konstanten Gehalt von 1 % O₂ für 24 Stunden über eine N₂ -Gaszufuhr, die von einem automatischen eingebauten Durchflussmesser gesteuert wird. Diese Zellen werden als ^H-NSCsbezeichnet. ^{Kontroll-N-NSCs}werden wie folgt generiert:
   1. Humane NSCs (Klon HB1.F3.CD) in DMEM-Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator unter 95 % Raumluft und 5 % CO₂ halten.

>2. Beladung humaner NSCs mit onkolytischen Viren (Abbildung 1B-1H)

1. Infizieren Sie ^NNSCs, ^HNSCs mit 50 bedingt replikativen Adenovirus (CRAd)-S-pk7 Viruspartikeln/Zelle.
2. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur mit regelmäßigem Klopfen werden die Zellen dreimal mit Medien gewaschen, um ungebundene Viruspartikel zu entfernen, und die Zellen zur Injektion in steriler Kochsalzlösung suspendiert.
   Vorsicht: Durchführung aller virusbezogenen In-vitro-Zellkulturverfahren in Einrichtungen mit der entsprechenden Biosicherheitsstufe, wie z. B. BSL2. Forschende, die mit dem onkolytischen Virus umgehen, müssen gemäß den Richtlinien für institutionelle Tierhaltungseinrichtungen geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.

>3. Intranasale Verabreichung von therapeutischen NSCs (Abbildungen 1D und Abbildung 2D)

1. Kultur und Sammlung von NSCs (^NNSCs, ^HNSCs).
2. Betäubung der Mäuse durch i.p. Injektion einer Ketamin-Xylazin-Mischung nach dem Verfahren:
   1. Betäubung des Tieres auf der Grundlage des Körpergewichts mit den zugelassenen Reagenzien, d. h. entweder durch intraperitoneale (i.p.) Injektion einer Mischung aus Ketamin (50–100 mg/kg; konsultieren Sie die institutionelle IACUC für den zugelassenen Dosisbereich) und Xylazin (5–10 mg/kg; konsultieren Sie die institutionelle IACUC für den genehmigten Dosisbereich) in steriler Kochsalzlösung von 200–250 μl, oder über eine 4–5%ige Isofluran-Anästhesie mit einem Inhalationsgerät.
3. Legen Sie die Mäuse mit dem Gesicht nach oben auf ein sauberes Tuch mit einem Heizkissen darunter, um die Körpertemperatur zu halten. Stellen Sie ein gepolstertes Kissen aus zusammengerollten Papiertüchern mit Klebebändern ein, um den aufrechten Winkel der Nasenlöcher zu gewährleisten, wenn sie unter den Kopf der Maus gelegt werden.
Geben
4. Sie mit einer Mikropipette 2 μl NSC-Suspension in jedes Nasenloch der Maus. Bestätigen Sie visuell die Aspiration des Tröpfchens, bevor Sie zur nächsten Maus wechseln. Die Gesamtzahl der gelieferten Zellen kann vom Benutzer bestimmt werden. Verwenden Sie 62.500 bis 125.000 Zellen/μl, so dass 0,5 bis 1 Million Zellen in Dosen von 4 x 2 μl verabreicht werden können.
5. Verwenden Sie einen Timer, um sicherzustellen, dass zwischen den einzelnen Verabreichungen der Zellsuspension bis zu 4 Mal 5 Minuten verabredet werden.
6. Lassen Sie die Tiere in einer Aufwachkammer wieder mobil werden, wobei die Rückenlage durchgehend beibehalten wird.

Ergebnisse

Abbildung 1: Ein Flussdiagramm für allgemeine Stammzellvorbereitungsverfahren vor der intranasalen Verabreichung. (A–C) Hypoxische Vorbehandlung oder genetische Modifikationen von Stammzellen zur Überexpression von CXCR4. (B–D) Wasch-, enzymatische Dissoziations-, Zellentnahme- und Zählschritte werden durchgeführt, um die Stammzellen anschließend mit therapeutisch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkulturbedarf (Kunststoffe)	ThermoFisher Scientific	Variiert	Austauschbar durch jede Quelle
Legend Micro 21R Kühl-Mikrozentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Austauschbar durch jede Quelle
Tischzentrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Austauschbar durch jede Quelle