Erzeugung von Mikrotumoren: Eine In-vitro-Kulturtechnik zur Kultivierung von 3D-Mikrotumoren zur Analyse des Ansprechens auf eine medikamentöse Behandlung

Zusammenfassung

Quelle: Gilbert, A. N. et al. Erzeugung von Mikrotumoren unter Verwendung des 3D-Human-Biogel-Kultursystems und von Patienten stammender Glioblastomzellen für die Erstellung von Kino-Profilen und Tests des Ansprechens auf Medikamente. J. Vis. Exp. (2016)

In diesem Video erzeugen wir Mikrotumoren aus Tumorzellen von Patienten mit humanem 3D-Biogel. Diese Mikrotumoren ähneln stark der in vivo Tumor-Mikroumgebung und dienen als potenzielle Plattformen für Wirkstofftests.

Protokoll

>1. Erzeugung von Mikrotumoren

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. Bereiten Sie ein vollständiges NBM vor, indem Sie Folgendes zu einer 500-ml-Flasche Neurobasales Medium (NBM) hinzufügen, um ein vollständiges NBM herzustellen: 10 ml B-27-Supplement ohne Vitamin A, 5 mL N2-Supplement, 100 μl EGF, 100 μl Fibroblast Growth Factor (FGF)-Basic, 5 mL Amphotericin B, 0,5 mL Gentamycin, 5 mL L-Glutamin und bereiten Sie neutralisiertes humanes Biogel hoher Dichte (HuBiogel) (HDHG bei 3 mg/ml) gemäß internem Protokoll vor. Ähnliche Biogel-Matrizen können ebenfalls verwendet werden.
2. Produktion und Kultur von Mikrotumoren
   1. Erhalten Sie frisch dissoziierte PDX-Zellen als Einzelzellsuspension in vollständiger NBM, auf Eis.
   2. Mischen Sie die Zellsuspension mit einem gleichen Volumen Trypanblau-Lösung (0,4 % in PBS) und analysieren Sie sie mit einem Hämozytometer, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss zu bestimmen. Entfernen Sie das Volumen, das zur Erzeugung von 50.000 Zellen/Mikrotumor erforderlich ist, wobei Volumen = (50.000 Zellen/Tumor * # Tumoren)/(Anzahl lebensfähiger Zellen / 1 ml) ist, und geben Sie es in ein frisches konisches Röhrchen.
   3. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 150 x g für 8 min bei Raumtemperatur konzentriert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit eiskalter HDHG-Lösung in einem Endverhältnis von 1 Teil Zellen in FBS und 4 Teilen HDHG.
   4. Verwenden Sie eine elektronische Mehrkanalpipette, um 10 μl pro Pin Zell-HDHG-Gemisch auf eine 96-polige Stahlplatte (mit hydrophober Beschichtung) zu dispensieren, um Mikrotumoren (2 mm Kügelchen mit jeweils 50.000 Zellen) zu erzeugen.
   5. Legen Sie die 3D-Tumorkügelchen für 15 Minuten in den Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO₂, befeuchtet), um die Kügelchen zu gelieren.
   6. Nach der Gelierung werden die Mikrotumoren (10 μl) mit der elektronischen Mehrkanalpipette und der speziellen Pin-Vorrichtung in eine kundenspezifische Suspensionskulturkammer (50 ml) oder eine großvolumige Kulturschale (10 cm) mit vollständigem NBM überführt.
   7. Nach 1–2 Tagen im Gewebekultur-Inkubator werden Mikrotumoren mit einer Weithalspipette auf 96-Well-Kulturplatten mit 50 μl NBM/Well übertragen und verschiedene Assay- und Analyseprotokolle durchgeführt.
3. Medikamentöse Behandlung und Aufrechterhaltung von Mikrotumoren
   1. Wählen Sie die Endkonzentrationen für die Arzneimitteluntersuchung aus.
      HINWEIS: Wenn das Arzneimittel in 2D-Kulturen eine bekannte Wirksamkeit aufweist, wählen Sie das 2-fache des IC50 als mittlere Dosiskonzentration und wählen Sie 3-fache serielle Verdünnungen nach oben und unten für insgesamt 5 Dosisstufen. Wenn der IC50 für das Arzneimittel in der 2D-Kultur beispielsweise 9 μM beträgt, wählen Sie 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM und 162 μM als Endkonzentration für die Arzneimittelprüfung.
   2. Bereiten Sie 2x Dosierlösung in komplettem NBM aus Dimethylsulfoxid (DMSO)-Bestand vor. Verdünnen Sie die Dosierlösung in 1 % DMSO-Medium, um eine 5-Dosen-Verdünnung mit 3-facher Serienverdünnung herzustellen.
   3. Geben Sie 50 μl Dosierlösung in die Mikrotumorvertiefung, die 50 μl in Assay-Platten enthält, um eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,5 % zu erreichen. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Replikat (z. B. 4) bei jeder in Schritt 1.3.1 festgelegten Arzneimitteldosis.
   4. Bewahren Sie die Kulturen 1–14 Tage lang in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ auf. Füttern Sie die Kulturen zweimal wöchentlich mit einer Frischung des Mediums und der Arzneimittellösung wie oben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kollagenase-I	Sigma-Aldrich	CO130
Neurobasal-A	Lebenstechnologien	Tel.: 10888-022
N-2 Ergänzung	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 17502-048	1x Endkonzentration
B-27 Supplement ohne Vitamin A	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 12587-010	1x Endkonzentration
Rekombinante humane FGF-basic	Lebenstechnologien	PHG0266	10 ng/mL Endkonzentration
L-Glutamin	Corning Cellgro Mediatech	25-005-CI	2 mM Endkonzentration
gentamicin	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 15750-060	50 ng/mL Endkonzentration
Trypan-Blau	Pierce ThermoScientific	Tel.: 15250-061
Hubiogel mit hoher Dichte	Vivo Biowissenschaften	HDHG-5
Dmso	Fischer	Nr. BP231	Zum Auflösen von Calcein AM & Compounds
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Ca/Mg	Corning Cellgro Mediatech	20-030-CV	1x verdünnt mit MiliQ Reinstwasser (für die Vorfixationswäsche)
10% neutrales gepuffertes Formalin	Protokoll	Tel.: 032-060
100 mm Petrischalen aus Glas	Fischer	08-748D