Glioblastom-Induktion mittels SB-vermittelter Transposition: Eine Technik zur Generierung eines neuartigen Mausmodells unter Verwendung der Transposon-vermittelten Integration von SB-Plasmid in das Gehirn von Neugeborenen

Zusammenfassung

Quelle: Calinescu, A. A. et al. Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die subventrikuläre Zone von neugeborenen Mäusen, um neuartige Modelle des Glioblastoms zu generieren. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video beschreibt eine effiziente Technik zur Induktion von Glioblastomen (GBM) mit Hilfe von Transposon-DNA, die in die Ventrikel von neugeborenen Mäusen injiziert wird. Zellen der subventrikulären Zone, die das Plasmid aufnehmen, transformieren, vermehren und Tumore mit histopathologischen Merkmalen des menschlichen GBM erzeugen.

Protokoll

>1. Intraventrikuläre Injektionen bei Neugeborenen

1. Richten Sie drei bis vier Wochen vor dem Versuch einen Mauszuchtkäfig mit einer männlichen und einer weiblichen Maus und einem plastikfarbenen Iglu ein. Dies bietet eine angereicherte Umgebung und unterstützt den Paarungsprozess.
2. Wenn die Trächtigkeit bestätigt ist, bringen Sie das Männchen in einen neuen Käfig. Achtzehn Tage nach der Verpaarung überwachen Sie den Käfig täglich auf die Geburt. Führen Sie intraventrikuläre Injektionen am postnatalen Tag 1 durch (P1).
3. Zubereitung der Injektionslösung.
   HINWEIS: Die Injektionslösung wird hergestellt, indem die Plasmid-DNA mit dem Transfektionsreagenz gemischt wird, um die Partikel für die Transfektion zu erzeugen. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für die Herstellung einer Injektionslösung unter Verwendung eines Plasmids, das für die Dornröschen-Transposase und Luciferase kodiert: pT2/SB100x-Luc und zwei Transposon-Plasmide: pT/CAGGS-NRASV12 und pT/CMV-SV40-LgT, in einem Verhältnis von 1:2:2. Alle Plasmide haben eine Konzentration von 2 μg/μL.
   1. Bereiten Sie die DNA-Lösung vor, indem Sie Folgendes hinzufügen: 4 μg (2 μl) pT2/SB100x-Luc, 8 μg (4 μl) pT/CAGGS-NRASV12 und 8 μg (4 μl) pT/CMV-SV40-LgT und 10 μl 10 % Glukose zu einem Endvolumen von 20 μl bei einer Konzentration von 1 μg/ml DNA und 5 % Glukose.
   2. Bereiten Sie die PEI-Lösung vor, indem Sie 2,8 μl In-vivo-Jet-PEI, 7,2 μl steriles Wasser und 10 μl 10 % Glukose zu einer Endkonzentration von 5 % Glukose hinzufügen.
   3. Geben Sie die PEI-Lösung in die DNA-Lösung, mischen Sie sie und wirbeln Sie sie und lassen Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) ruhen. Die Lösung ist nun bereit für die Injektion. Halten Sie die Lösung nach einer Stunde bei RT auf Eis.
   4. Setzen Sie eine saubere 10-μl-Spritze mit einer 30-G-Injektionsnadel mit 12,5°-Abschrägung in die Mikropumpe ein (Abbildung 1 #1).
4. Um die ordnungsgemäße Funktion des Injektionssystems zu überprüfen, ziehen Sie mit dem automatischen Injektor (Abbildung 1 #1) 10 μl Wasser in die Spritze auf und entleeren Sie die Spritze dann vollständig.
5. Kühlen Sie das stereotaktische Stadium des Neugeborenen (Abbildung 1 #3) mit einer Aufschlämmung aus Trockeneis und Alkohol auf eine Temperatur von 2–8 °C ab.
6. Induzieren Sie die Narkose, indem Sie die Welpen für 2 Minuten auf nasses Eis legen. Die Anästhesie wird für den Rest des Eingriffs auf dem gekühlten stereotaktischen Rahmen fortgesetzt. Wenn Sie die Temperatur des Rahmens über dem Gefrierpunkt zwischen 2 und 8 °C halten, werden thermische Verbrennungen vermieden. Als besondere Vorsichtsmaßnahme können Welpen in Gaze gewickelt werden, bevor sie auf nasses Eis gelegt werden.
7. Füllen Sie die Spritze mit der DNA/PEI-Lösung.
8. Immobilisieren Sie den Welpen im stereotaktischen Rahmen, indem Sie seinen Kopf zwischen die mit Gaze bedeckten Ohrstangen legen (Abbildung 1b). Achten Sie darauf, dass die dorsale Seite des Schädels horizontal und parallel zur Oberfläche des Rahmens verläuft und dass die Schädelnähte deutlich sichtbar sind. Wischen Sie den Kopf mit 70% Ethanol ab.
9. Senken Sie die Nadel der Spritze ab und stellen Sie die stereotaktischen Koordinaten mit den Drehreglern des stereotaktischen Rahmens ein, bis die Nadel das Lambda (den Mittellinienschnittpunkt des parietalen und des okzipitalen Knochens) berührt (Abbildung 1b).
10. Heben Sie die Nadel an und stellen Sie die stereotaktischen Koordinaten auf 0,8 mm lateral und 1,5 mm rostral zum Lambda ein (Abbildung 1b).
11. Senken Sie die Nadel, bis sie die Haut berührt und leicht einzieht. Messen Sie die Koordinaten. Senken Sie die Nadel um weitere 1,5 mm ab. Die Nadel durchsticht die Haut und den Schädel und dringt durch die Hirnrinde, um in den lateralen Ventrikel einzudringen (Abbildung 1c).
12. Injizieren Sie mit dem automatischen Injektor 0,75 μl der DNA/PEI-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,5 μl/min.
13. Lassen Sie den Welpen eine weitere Minute auf dem Rahmen, damit sich die Lösung in den Ventrikeln verteilen kann. In der Zwischenzeit betäuben Sie einen anderen Welpen 2 Minuten lang auf Eis, um sich auf die nächste Injektion vorzubereiten.
14. Heben Sie die Nadel vorsichtig und langsam an und legen Sie den Welpen unter eine Heizlampe. Überwachen Sie Atmung und Aktivität. Stimulieren Sie bei Bedarf die Gliedmaßen sanft, bis die erste Atmung erfolgt.
15. Bringen Sie den Welpen zu seiner Mutter zurück, nachdem er sich aufgewärmt hat, eine rosige Farbe angenommen hat, regelmäßig atmet und aktiv ist, normalerweise 5-7 Minuten. Wenn mehr als ein Welpen gleichzeitig injiziert wird, halten Sie alle Welpen zusammen, bis alle Injektionen durchgeführt sind. Wenn die Injektionen länger als 30 Minuten dauern, geben Sie die Hälfte der Welpen nach den ersten 30 Minuten und den Rest am Ende des Eingriffs zurück.
16. Überwachen Sie, dass die Hündin auf ihre Jungen reagiert und sich um sie kümmert. Wenn nötig, fügen Sie eine Leihmutter in den Käfig ein.
17. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen dem Aufstellen des Welpen auf Eis und dem Platzieren unter der Wärmelampe weniger als 10 Minuten beträgt. Je schneller der Eingriff, desto besser das Überleben. Normalerweise beträgt die Zeit, die benötigt wird, um einen Welpen zu betäuben und zu injizieren, 4 Minuten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Versuchsaufbau und Leitfäden für intraventrikuläre Injektionen bei neonatalen Mäusen. ein)Ein stereotaktischer Rahmen (2) mit Mikrometer-Skalen ist mit einem automatischen Injektor ausgestattet, der eine 10-μl-Spritze (4) aufnehmen kann. Im Inneren des U-Rahmens ist ein Adapterrahmen für Neugeborene sicher befestigt (3). Das Bedienfeld des automatischen Injektors (1) ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Stoelting's Laborstandard mit Ratten- und Mausadaptern	Stoelting	Artikel-Nr.: 51670	Andere Unternehmen stellen ähnliche Rahmen her, von denen jeder mit kleinen Mausadaptern geeignet ist
Quintessenz des stereotaktischen Injektors (QSI)	Stoelting	Artikel-Nr.: 53311	Injektionen können auch ohne Injektionen durchgeführt werden, aber der automatische Injektor ermöglicht eine erhöhte Reproduzierbarkeit und Komfort
10 μL 700 Serie handangepasste MICROLITER-Spritze	Hamilton	Modell 701	Dieses Spritzenmodell liefert zuverlässig 0,5 bis 500 μl Lösung. Andere Spritzen (z. B. 5 μL, Modell 75) können ebenfalls verwendet werden
30 Gauge Injektionsnadel (1,25", 15^{o} Fase)	Hamilton	S/O# 197462	Diese Nadel ist ideal, um die Haut und den Schädel einer neugeborenen Maus zu durchstechen, ohne dass andere invasive Verfahren erforderlich sind. Wenn es stumpf wird (nicht leicht in die Haut eindringt), muss es ersetzt werden.
In-vivo-Jet-PEI	Polyplus-Transfektion	201-10G	Aliquot in kleinen Volumina und bei -20ºC aufbewahren
D-Luciferin, Kaliumsalz	Goldbio.com	LuckK-1g	Andere Quellen für Glühwürmchen-Luziferase sind ebenso ausreichend
Hämatoxylin-Lösung, Harris-modifiziert	Sigma Aldrich	HHS128-4L