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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Sezieren
HINWEIS: Sterile Bedingungen sind nicht erforderlich, es sei denn, Gefäße werden für Zellkulturzwecke verwendet. Bereiten Sie Isoliergefäßlösungen vor: B1, fügen Sie 1,5 ml HEPES 1M zu 150 mL HBSS hinzu; B2, fügen Sie 3,6 g Dextran zu 20 ml B1 hinzu; B3, fügen Sie 1 g BSA zu 100 mL B1 hinzu.
- Bereiten Sie ein 150-ml-Becherglas mit 20 mL B1 vor. Auf Eis aufbewahren und mit Parafilm abdecken, um Luftkontamination zu vermeiden.
- Betäuben Sie die Maus unter einer Kapuze mit einem kleinen Papiertuch, das in 1 ml reinem Isofluran getränkt ist und in den Käfig gegeben wird. Die Anästhesie wird durch eine fehlende Reaktion auf ein Zehenklemmen bestätigt. Töte die Maus durch Zervixluxation.
Anmerkung: Diese Schritte werden in Übereinstimmung mit den nationalen und institutionellen Vorschriften durchgeführt.
- Optional: Führen Sie eine intrakardiale Perfusion mit 20 mL PBS 1x durch, um den Blutgehalt zu eliminieren.
- Schneide die Haut mit einem Skalpell vom Hals bis zur Nase ab und ziehe sie weg. Entfernen Sie alle kontaminierenden Haare mit PBS 1x.
- Um den Schädel zu öffnen, führen Sie zuerst eine Schere vor dem Riechkolben ein und öffnen Sie die Schere, um den Schädel in zwei Teile zu zerreißen.
- Entferne das Gehirn vorsichtig mit einem Gehirnspatel. Präparieren Sie den Plexus choroideus aus den Seitenventrikeln, da diese die Blutgefäßpräparation verunreinigen würden.
Anmerkung: Optional: Die abschließende Präparation enthält Parenchym- und Hirnhäutegefäße. Falls nicht gewünscht, können Hirnhäute abgezogen werden.
- Übertragen Sie das Gehirn in das Becherglas mit der B1-Lösung auf Eis. Bis zu 8 Gehirne können zusammen behandelt werden.
>2. Homogenisierung von Hirngewebe
- Mit zwei Skalpellen das Gehirn manuell und kräftig in der B1-Lösung schlagen, anschließend kleine Stücke von etwa 2 mm erhalten.
- Homogenisieren Sie die Zubereitung mit einem automatisierten Dounce-Homogenisator, der 20 Hübe bei 400 U/min ausführt. Achten Sie darauf, dass das Glasrohr im Eis gehalten wird und dass der obere Teil des Strahlers beim Auf- und Abbewegen in Lösung ist, um die Bildung von Lufteinschlüssen zu verhindern. Wenn mehrere Proben vorbereitet werden, waschen Sie den Douncer zwischen jeder Homogenisierung mit ionisiertem Wasser.
>3. Reinigung von Gefäßen
- Übertragen Sie das Homogenat in ein 50 mL Kunststoffröhrchen und fahren Sie mit der Zentrifugation bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C fort. Auf der Oberseite des Gefäßpellets bildet sich eine große weiße Grenzfläche (hauptsächlich Myelin) (rot, wenn keine Perfusion durchgeführt wurde).
- Entsorgen Sie den Überstand. Das Behälterpellet und die weiße Schnittstelle bleiben aneinander befestigt. Fügen Sie 20 mL eiskalte B2-Lösung hinzu und schütteln Sie das Röhrchen manuell und kräftig für 1 min.
- Fahren Sie mit der zweiten Zentrifugation bei 4.400 x g für 15 min bei 4 °C fort. Das Myelin bildet nun eine dichte weiße Schicht an der Oberfläche des Überstands.
- Löse die Myelinschicht vorsichtig von den Wänden der Röhre, indem du die Röhre festhältst und langsam drehst, damit der Überstand an den Wänden entlang passieren kann. Myelin mit dem Überstand verwerfen. Das Pellet, das die Gefäße enthält, bleibt am Boden des Rohrs haften.
- Tupfen Sie die Innenwand des Röhrchens mit einem saugfähigen Papier ab, das um eine 5-ml-Kunststoffpipette gewickelt ist, und entfernen Sie alle Restflüssigkeiten, vermeiden Sie es, das Gefäßpellet zu berühren. Halten Sie die Tube kopfüber auf ein saugfähiges Papier, um die restliche Flüssigkeit abzulassen.
- Suspendieren Sie das Pellet in 1 ml eiskalter B3-Lösung, indem Sie mit niedrig bindenden Spitzen auf und ab pipettieren, das Röhrchen auf Eis halten, und fügen Sie dann weitere 5 ml B3-Lösung hinzu. Achten Sie darauf, dass die Gefäße so weit wie möglich verteilt sind und keine Aggregate bilden.
>4. Filtration
- Bereiten Sie ein Becherglas auf Eis mit 30 ml eiskalter B3-Lösung vor. Mit Parafilm abdecken, um Luftverunreinigungen zu vermeiden.
- Ein Filter mit einer Maschenweite von 20 μm wird auf einen modifizierten Filterhalter auf der Oberseite eines Becker-Kolbens aufgesetzt und durch Auftragen von 10 ml eiskalter B3-Lösung äquilibriert.
- Gießen Sie die Gefäßvorbereitung auf den Filter und spülen Sie die Gefäße mit 40 ml eiskalter B3-Lösung aus.
- Den Filter mit einer sauberen Pinzette zurückholen und sofort in das Becherglas mit der B3-Lösung tauchen. Nehmen Sie die Gefäße durch leichtes Schütteln vom Filter ab.
- Den Becherinhalt in ein 50 mL Kunststoffröhrchen geben und bei 2.000 x g für 5 min bei 4°C zentrifugieren.
Anmerkung: Alternativ kann die Suspension der Hirngefäße aus Schritt 3.6 auf einen 100-μm-Maschenfilter filtriert werden. In diesem Fall werden größere Gefäße bevorzugt auf dem Filter zurückgehalten, während der Durchfluss Mikrogefäße (hauptsächlich Kapillaren) enthält, die dann wie oben auf einem 20 μm-Maschenfilter filtriert werden.
- Resuspendieren Sie das Pellet der Mikrogefäße in 1 mL eiskalter B3-Lösung und übertragen Sie es durch Pipettieren in ein 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C.