In-vitro-Phagozytose-Assay: Eine auf Live-Bildgebung basierende Methode zur Untersuchung der Echtzeit-Astrozyten-vermittelten Synaptosomen-Phagozytose

Zusammenfassung

Quelle: Byun, Y. G., Chung, W. S. Ein neuartiger In-vitro-Live-Imaging-Assay der Astrozyten-vermittelten Phagozytose unter Verwendung von pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen. J. Vis. (2018)

In diesem Video bewerten wir die phagozytische Kapazität von gereinigten Astrozyten in vitro durch Live-Imaging-Assays. Der Assay dient als effektive Screening-Plattform zur Identifizierung chemischer Verbindungen, die die phagozytische Kapazität von Astrozyten erhöhen oder hemmen können.

Protokoll

>1. Phagozytose-Live-Imaging-Assay (Abbildung 1)

1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte (oder eine beliebige Platte/Schale, die für die Live-Bildgebung vorbereitet ist) vor, in der Astrozyten konfluent sind (in der Regel sind 7 bis 10 Tage Inkubation nach der Reinigung ideal, um die Zellen zu stabilisieren).
2. Entfernen Sie das Medium in jeder Vertiefung und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1 ml Dulbecco-Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (DPBS). Um die Luftbelastung zu minimieren, waschen Sie die Vertiefungen schnell.
3. Fügen Sie 300 μl immunpanierte Astrozyten-Basismedien (IP-ABM) mit 5 μl pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen und zusätzlichen Faktoren wie immunpanierten Astrozyten-konditionierten Medien (IP-ACM) hinzu, die die Phagozytose von Gliazellen modulieren können.
4. Inkubieren Sie die Platte in einem CO₂ -Inkubator für 40 min. Dieser Schritt ermöglicht es den pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen, sich am Boden der Platten abzusetzen.
5. Entfernen Sie das Medium mit ungebundenen Synaptosomen mit pH-Indikator-Konjugosom und waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 1 ml DPBS.
   Vorsicht: Nicht zu stark waschen. Um die Luftbelastung zu minimieren, waschen Sie die Vertiefungen schnell.
6. Geben Sie 500 μl IP-ABM mit zusätzlichen Faktoren zum Testen in die Vertiefungen.
7. Bringen Sie die Platte zu einem Live-Imaging-Instrument und wählen Sie Positionen aus. Passen Sie Fokus, Belichtungszeit, Helligkeit und LED-Leistung an.
   Anmerkung: Die Einstellungen für Belichtungszeit, Helligkeit und LED-Leistung sind je nach Fluoreszenzintensität und Zweck des Experiments variabel. Im Live-Imaging-Assay mit pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen stellen wir diese Werte in der Regel wie folgt ein: Belichtung: ~150–200 ms, Helligkeit: 15 und LED-Leistung: 4–6.
8. Legen Sie das Bildformat, das Zeitintervall und die Gesamtzahl der Zyklen für die Live-Bildgebung fest. Stellen Sie das Zeitintervall auf 1 oder 2 Stunden ein, je nachdem, wie viele Positionen ausgewählt sind. 2-Stunden-Intervalle werden empfohlen, wenn mehr als 150 Positionen für die Live-Bildgebung ausgewählt werden.
9. Starten Sie die Live-Imaging-Experimente.

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Phagozytose-Live-Imaging-Assays.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
pHrodorot, Succinimidylester	Molecula-Sonden	Nr. P36600	Für die Konjugation von pH-Indikatoren
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	Artikel-Nr.: 16000-044
DMEM	Gibco	Tel.: 11960-044
dPBS	Welgene	Artikel-Nr.: LB001-02
Phagozytose-Live-Imaging-Assay
Abschnitt Juli	NanoEntek
Time Series Analyzer V3-Plugins	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html