Ex-vivo-Elektroporation von Kleinhirnschnitten von Kükenembryonen: Eine Methode zur Einführung von Plasmid-DNA, die für grün fluoreszierendes Protein kodiert, um die Entwicklung granularer Zellen zu visualisieren

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Hanzel, M. et al.Ex vivo Kultur von Küken-Kleinhirnschnitten und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorläufern.J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video führen wir die Elektroporation von Kleinhirnschnitten von Kükenembryonen mit Reportergen-Plasmiden durch. Die Technik ermöglicht die Visualisierung der Entwicklung und Migration von Körnerzellvorläufern zur Bildung einer granularen Schicht.

Protokoll

>1. Elektroporation von Schichten

Konstruieren Sie eine Elektroporationskammer, indem Sie die Anode eines Elektroporators mit Isolierband an der Basis einer 60 mm Petrischale befestigen. Fügen Sie ca. 1 ml HBSS hinzu, um die Elektrode abzudecken.
Platzieren Sie einen 0,4-μm-Kultureinsatz auf der mit HBSS bedeckten Elektrode. Lassen Sie den Kultureinsatz auf der Elektrode ruhen und stellen Sie sicher, dass immer Kontakt zwischen dem Einsatz und der Elektrode besteht.
Anmerkung: Bei diesem Aufbau ruht der Kultureinsatz mit den Scheiben auf der Oberfläche der Lösung, wobei der Schaltkreis erhalten bleibt, aber eine räumliche Ausrichtung der Kathode möglich ist.
Übertragen Sie die identifizierten Scheiben (bis zu fünf pro Kultureinsatz) mit einer 3-ml-Pasteurpipette mit der abgeschnittenen Spitze auf den Kultureinsatz. Trennen Sie die Anlage und lassen Sie sie in sagittaler Ausrichtung auf dem Kultureinsatz absetzen.
Entfernen Sie mit einer Pipette überschüssiges HBSS, so dass die Scheiben nicht mehr in Lösung gebadet werden.
Mit einer P10-Pipettenspitze pipettiert die DNA (in einer Konzentration von 1 μg/μl) mit 20 % Schnellgrün auf der Oberfläche des Zielbereichs einer Scheibe. 20 % Schnellgrün sorgt für eine viskose DNA-Lösung und verhindert eine unerschwinglich breite Streuung der DNA. Geben Sie ca. 5 μl DNA/schnelle grüne Lösung zu jeder Scheibe (Abbildung 1B).
Platzieren Sie die Kathode über dem gewünschten Zielgewebe und elektropolieren Sie sie mit 3 x 10 V und 10 ms Dauer. Vermeiden Sie den direkten Kontakt der Kathode mit dem Gewebe. Nutzen Sie stattdessen die Oberflächenspannung der Flüssigkeit, um den Leitwert aufrechtzuerhalten (platzieren Sie die Kathode so nah wie möglich am Gewebe, ohne das Gewebe tatsächlich zu berühren).
Wiederholen Sie die DNA-Abgabe und Elektroporation in mehrere Regionen von EGL auf jedem einzelnen Kleinhirnschnitt wie gewünscht.
Nach Abschluss der Elektroporation den Kultureinsatz in eine 30-mm-Petrischale übertragen.
Geben Sie zu jeder Kultur 1 ml vorgewärmtes Nährmedium (Basal Medium Eagle, 0,5 % (w/v) D-(+)-Glucose, 1 % B27-Supplement, 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin) unter den Kultureinsatz, so dass der Kultureinsatz mit dem Medium in Kontakt kommt, die Scheiben jedoch nicht darin gebadet werden.
Inkubieren Sie Kulturen bei 37 °C/6 % CO₂ für bis zu 3 Tage. Ersetzen Sie den gesamten Nährboden alle 24 Stunden durch frisches, vorgewärmtes Medium.
Nach der Kultur die Scheiben auf den Kultureinsätzen 1 Stunde lang in 4 % Paraformaldehyd (oder O/N bei 4 °C) in einer frischen 30-mm-Schale ohne Nährmedium fixieren.

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Ergebnisse

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Abbildung 1. Aufbau der Elektroporationskammer. (A) Ein Bild der maßgefertigten Elektroporationskammer. Die Kammer besteht aus der Anode eines Elektroporators, der sicher auf dem Boden einer 60 mm Petrischale sitzt. Die Schale enthält ca. 1 ml HBSS, um die Elektrode abzudecken. Der Kultureinsatz sollte auf der Elektrode mit ständigem Kontakt zwischen dem Einsatz u...