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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Kleinhirndissektion und Schnittvorbereitung (Hands-on-Zeit ≈ 15–20 min pro Tier)
- Stellen Sie eine der 60-mm-Zellkulturschalen mit dem eiskalten Dissektionsmedium unter das Binokularmikroskop und entfernen Sie die obere Platte.
- Tupfen Sie das Kopffell mit 70%igem Ethanol ab (wobei Sie vorsichtig vermeiden sollten, die Augen des Tieres zu berühren) und enthaupten Sie das Tier mit einer großen, scharfen Schere nach dem zugelassenen Verfahren.
HINWEIS: Die Kleinhirnschnitte werden von P9-P10-Mäusen ohne spezifische Geschlechts- oder Stammverzerrung erzeugt.
- Schneide die Haut mit einer kleinen Schere entlang der Mittellinie des Kopfes vom Hals bis zur Mausschnauze auf.
- Um den Kopf zu halten und den Schädel freizulegen, falten Sie die Haut ventral unter dem Kopf zurück und kneifen Sie die beiden Hautfalten zwischen den Fingern zusammen.
- Führen Sie die kleine Schere vorsichtig in das Foramen magnum ein und schneiden Sie den Schädel mit einem seitlichen Schnitt zur Seite und schneiden Sie dann rund um den Kopfschädel ein. Halten Sie die Spitze der Schere beim Schneiden so parallel und nah wie möglich am Schädel, um das Hirngewebe nicht zu beschädigen.
- Den dorsalen Teil des Schädels mit einer fein-geraden Pinzette entnehmen. Während Sie den dorsalen Teil des Schädels vorsichtig anheben, schneiden Sie die anhaftenden Hirnhäute (durchscheinende Spülmembran, die das Hirngewebe umgibt) bei Bedarf mit einer kleinen Schere durch, um das Hirngewebe nicht zu beschädigen.
- Führen Sie vorsichtig eine fein-gerade Pinzette (oder alternativ einen Spatel) zwischen ventralen Schädel und Gehirn ein, klappen Sie das Gehirn vorsichtig heraus und schneiden Sie den Sehnerv und den Trigeminusnerv mit einer kleinen Schere durch.
- Helfen Sie dem Gehirn, durch die Schwerkraft in die 60 mm Zellkulturschale mit eiskaltem Dissektionsmedium zu fallen, indem Sie den Kopf knapp über der Schale auf den Kopf stellen und bei Bedarf mit einer kleinen Schere die letzten Verwachsungen lösen.
- Richten Sie das Gehirn mit einer feinen Pinzette so aus, dass die dorsale Seite dem Forscher zugewandt ist und die ventrale Seite auf dem Boden der Schale liegt.
- Verwenden Sie unter dem binokularen Mikroskop die fein-gerade Pinzette, um das Gehirn auf der Vorderhirnseite zu immobilisieren und das Hinterhirn nicht zu berühren, da es beschädigt werden könnte. Trennen Sie das Hinterhirn vom Rest des Gehirns (Vorder- und Mittelhirn, siehe Schema in Abbildung 1Aa) mit einer fein-geraden Pinzette. Um das Kleinhirn vom Rest des Hinterhirns zu trennen, wird mit einer feinen Pinzette die Kleinhirnstiele unterhalb des Kleinhirns durchtrennt (siehe Schema in Abbildung 1Aa').
- Sobald das Kleinhirn isoliert ist, reißen Sie die Hirnhäute vorsichtig mit einer fein-geraden Pinzette ab (siehe Schema in Abbildung 1Aa').
- Halten Sie das Kleinhirn vorsichtig mit der fein gebogenen Pinzette fest und platzieren Sie es mit der Rückenseite nach oben senkrecht zur Rasierklinge des Choppers auf die Kunststoffplattform (siehe Schema in Abbildung 1Bb).
- Aspirieren Sie überschüssiges Dissektionsmedium um das Kleinhirn herum mit einer sterilen Dünnendpipettenspitze, die an eine 1-ml-Pipette angepasst ist (siehe Schema in Abbildung 1Bb).
- Stellen Sie sicher, dass das Kleinhirn flach aufliegt, aber nicht gedehnt wird, sobald es auf die Plattform gelegt wird, um optimale sagittale Schnitte während des Schnitts zu erhalten (siehe Schema in Abbildung 1Bb).
- Schneiden Sie 300 μm dicke sagittale Schnitte des Kleinhirns mit dem Gewebehacker auf (siehe Schema in Abbildung 1Bb'). Die Kraft und Geschwindigkeit des Sägeblattes müssen vor Ort optimiert werden.
- Geben Sie vorsichtig einen Tropfen Seziermedium auf das in Scheiben geschnittene Kleinhirn. Mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung, die auf eine 1-ml-Pipette aufgesetzt wird, das aufgeschnittene Kleinhirn langsam aspirieren und zurück in die 60-mm-Zellkulturschale mit eiskaltem Dissektionsmedium übertragen (siehe Schema in Abbildung 1Bb'').
- Reinigen Sie die Kunststoffplattform des Tissue-Choppers mit 100 % Ethanol zwischen jedem Kleinhirnschnitt. Lassen Sie das Ethanol verdampfen, bevor Sie das nächste Kleinhirn auf die Plattform stellen.
- Trennen Sie die einzelnen Scheiben mit zwei feinen und geraden Pinzetten (oder alternativ Titannadeln) und wählen Sie 6–8 Scheiben aus dem Grün aus (siehe Schema in Abbildung 1Cc und 1Cc').
- Nehmen Sie eine 6-Well-Platte mit Kultureinsätzen und übertragen Sie bis zu 4 ausgewählte Scheiben zusammen mit etwas Dissektionsmedium auf einen Kultureinsatz, wobei Sie eine Pipettenspitze mit breitem Durchgang verwenden, die an eine 1-ml-Pipette angepasst ist (siehe Schema in Abbildung 1Cc').
- Legen Sie die Scheiben in die Mitte des Kultureinsatzes, indem Sie das Seziermedium oder die Pinzette verwenden, um sie vorsichtig an die richtige Stelle zu schieben und zu ziehen, so dass sie nicht miteinander in Berührung kommen (siehe Schema in Abbildung 1Cc').
- Entfernen Sie überschüssiges Seziermedium um die Scheiben herum mit einer dünnen Pipettenspitze. Es ist darauf zu achten, dass die Scheiben flach auf der Membran aufliegen (siehe Schema in Abbildung 1Cc').
- Legen Sie die 6-Well-Platte sofort in den Inkubator, nachdem Sie die Scheiben auf die Membran gelegt haben.
