Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung der Scheibenkultur
- Bereiten Sie organotypische Hippocampus-Schnittkulturen von Mäusen mit postnatalen 6 bis 7 Tage alten Mäusen beiderlei Geschlechts vor.
Bereiten Sie das - Dissektionsmedium für eine organotypische Schnittkultur vor, bestehend aus (in mM): 238 Saccharose, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 und 11 Glukose in deionisiertem Wasser, dann Gas mit 5 % CO2/95 % O2 bis zu einem pH-Wert von 7,4.
- Bereiten Sie organotypische Schnittkulturmedien vor, bestehend aus: 78,8 % (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20 % (v/v) Pferdeserum, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM Glukose, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, Insulin (1 μg/ml) und 0,06 mM Ascorbinsäure, pH-Wert angepasst auf 7,3. Stellen Sie die Osmolarität mit einem Osmometer auf 310–330 Osmol ein.
- Präparieren Sie Hippocampus aus dem gesamten Gehirn mit zwei Spateln und schneiden Sie mit einem Gewebezerkleinerer (400 μm) in Scheiben. Trennen Sie die Scheiben mit zwei Pinzetten und geben Sie sie auf 30-mm-Zellkultureinsätze in einer 6-Well-Platte, die mit Nährmedien (950 μl) unter den Einsätzen gefüllt ist.
- Lagern Sie organotypische Schnittkulturen in einem Gewebekultur-Inkubator (35 °C, 5 % CO2) und wechseln Sie die Schnittkulturmedien alle zwei Tage.
>2. Plasmid-Vorbereitung
- Bereiten Sie das Plasmid für das gewünschte Gen vor.
- Subkloniertes EGFP-Gen (Enhanced Green Fluorescent Protein) in einen pCAG-Vektor.
- Reinigen Sie das pCAG-EGFP-Plasmid mit einem endotoxinfreien Aufreinigungskit und lösen Sie es in einer internen Lösung, die aus mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser besteht, das 140 mM K-Methansulfonat, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 und 10 mM HEPES enthält, angepasst auf pH 7,3 mit KOH (Plasmidkonzentration: 0,1 μg/μl).
>3. Vorbereitung der Glaspipette
- Ziehen Sie Pipetten aus Borosilikatglas (4,5–8 MΩ) auf einen Mikropipettenabzieher (Abbildung 1A).
Anmerkung: Die Glaspipetten, die für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen verwendet werden, sind ideal für die Elektroporation.
- Glaspipetten über Nacht bei 200 °C backen, um sie zu sterilisieren.
- Überprüfen Sie die Größe der Pipettenspitze unter einem Präpariermikroskop, um den elektrischen Widerstand zu ermitteln.
- Optional: Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand, indem Sie die Pipette an der Elektroporationselektrode befestigen und die Pipettenspitze mit dem Mikromanipulator in filtersterilisiertes künstliches Liquor cerebrospinalis (aCSF) manövrieren, das (in mM) enthält: 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 und 11 Glukose in deionisiertem Wasser, vergast mit 5 % CO2/95 % O2auf einen pH-Wert von 7,4. Bestätigen Sie den tatsächlichen Widerstand mit der Anzeige am Elektroporator.
Anmerkung: Je schärfer die Pipettenspitze, desto größer ist der elektrische Widerstand. Der Pipettenwiderstand sollte unter 10 MΩ liegen. Glaspipetten mit hohem Pipettenwiderstand (Abbildung 1B) verstopfen bei wiederholter Elektroporation häufig an der Spitze.
>4. Aufbau des Elektroporations-Rigs
- Installieren Sie den Elektroporator an einem Standard-Ganzzell-Elektrophysiologie-Rig, das mit einem aufrechten Mikroskop ausgestattet ist, das auf einem Verschiebetisch mit einem Mikromanipulator und einer Peristaltikpumpe montiert ist.
- Installieren Sie die Kopfstufe des Elektroporators auf einem Mikromanipulator und schließen Sie ein Paar Lautsprecher an den Elektroporator an. Verbinden Sie den Elektroporator mit einem Fußpedal, mit dem ein Impuls gesendet werden kann, wenn er bereit ist.
Anmerkung: Die Lautsprecher geben beim Einschalten einen Ton ab, der ein Indikator für den elektrischen Widerstand an der Elektrode ist. Auf diese Weise ist es möglich, relative Änderungen des Widerstands zu bestimmen, ohne die Aufmerksamkeit vom Eingriff abzulenken.
>5. Vorbereitung der Elektroporation
- Übertragen Sie Scheibenkultureinsätze von 6-Well-Platten in 3-cm-Petrischale, die mit 900 μl Nährmedien beladen sind, und lagern Sie sie in einem CO2 -Inkubator auf dem Tisch, bis sie für die Elektroporation bereit sind.
- Frische Kultureinsätze mit Scheibenkulturmedien (1 ml) für mindestens 30 Minuten in einer 3,5 cm Petrischale vorinkubieren, um die Scheiben nach der Elektroporation zu kultivieren.
- Reinigen Sie das Bohrgerät und bereiten Sie es für die Elektroporation vor.
- Perfundieren Sie die Leitungen 5 Minuten lang mit 10 % Bleichmittel, um den Schlauch und die Kammer zu sterilisieren, bevor Sie mit dem Experiment für den Tag beginnen.
- Perfundierten Sie die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit entionisiertem autoklaviertem Wasser, um sie vollständig zu spülen.
- Perfundieren Sie die Leitungen mit filtersterilisiertem aCSF, das 0,001 mM Tetrodotoxin (TTX) enthält.
Anmerkung: TTX minimiert die zelluläre Toxizität und den Tod aufgrund von Übererregung der Interneuronen.
- Stellen Sie die Impulsparameter des Elektroporators ein: Amplitude von –5 V, Rechteckimpuls, Zug von 500 ms, Frequenz von 50 Hz und eine Impulsbreite von 500 μs.
- Füllen Sie die Glaspipette mit 5 μl plasmidhaltiger interner Lösung.
- Entfernen Sie alle eingeschlossenen Luftblasen von der Pipettenspitze, indem Sie mehrmals vorsichtig auf die Spitze schnippen und klopfen.
- Überprüfen Sie die Spitze auf Beschädigungen, indem Sie sie unter einem Präpariermikroskop visualisieren oder indem Sie Schritt 3.3.1 wiederholen, um den Pipettenwiderstand zu überprüfen.
Anmerkung: Wenn die Spitze beschädigt ist, muss die Glaspipette verworfen werden, und dieser Schritt muss mit einer neuen Glaspipette wiederholt werden, die zuvor in Schritt 3 vorbereitet wurde.
- Befestigen Sie die Pipettenspitze fest an der Elektrode und schalten Sie die Lautsprecher ein. Notieren Sie die Anzeige (den Widerstand der Pipette) des Elektroporators, wenn die Spitze mit dem aCSF-Medium in Berührung gekommen ist.
- Schneiden Sie die Membran des Kultureinsatzes mit einer scharfen Klinge ab und isolieren Sie eine Scheibenkultur. Übertragen Sie die Scheibenkultur vorsichtig mit einer spitzwinkligen Pinzette in die Elektroporationskammer und fixieren Sie ihre Position mit einem Scheibenanker.
- Bewahren Sie die Scheibenkultur nicht länger als 30 Minuten außerhalb des Inkubators auf, um Nebenwirkungen wie Veränderungen der neuronalen Gesundheit oder Funktion zu vermeiden.
>6. Interessante Elektroporatzellen
- Üben Sie mit dem Mund oder mit einer 1-ml-Spritze (0,2–0,5 mL), die am Schlauch befestigt ist, einen positiven Druck auf die Pipette aus.
- Verwenden Sie die 3-dimensionalen Drehregler des Mikromanipulators, um die Pipettenspitze in die Nähe der Oberfläche der Schnittkultur zu manövrieren.
- Wählen Sie eine Zielzelle und nähern Sie sich ihr, wobei Sie den positiven Druck beibehalten, bis sich auf der Zelloberfläche ein Grübchen bildet, das am Mikroskop sichtbar ist.
- Führen Sie Druckzyklen durch.
- Üben Sie schnell einen milden Unterdruck mit dem Mund aus, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Dichtung bildet, was optisch daran erkennbar ist, dass die Membran etwas in die Pipettenspitze eindringt. Beobachten Sie eine Erhöhung des Pipettenwiderstands (~2,5x des Anfangswiderstands), indem Sie auf eine Zunahme des Tons aus den Lautsprechern achten. Üben Sie schnell wieder Überdruck aus, damit sich das Grübchen wieder bildet.
- Führen Sie sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen ohne Pause durch und halten Sie dann den Unterdruck für 1 s.
Anmerkung: Das Pausieren zwischen den Zyklen, das Ausüben von zu viel Druck oder das Halten des Unterdrucks über einen zu langen Zeitraum kann zu erheblichen Zellschäden führen und möglicherweise dazu führen, dass die Zelle während der Elektroporation abstirbt.
- Pulsieren Sie den Elektroporator einmal schnell mit dem Fußpedal, wenn der Ton aus den Lautsprechern einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe erreicht, der den Spitzenwiderstand anzeigt. Warten Sie nicht länger als 1 s auf den Spitzenwiderstand, bevor Sie den Impuls senden.
Anmerkung: Wir haben bei der Verwendung dieses Protokolls keine Off-Target-Elektroporation beobachtet. Es wurden nur die Zellen transfiziert, die während der Druckzyklen mit der Glaspipette in Kontakt kamen. Die Positionierung der Pipette in der Nähe anderer Neuronen führt nicht zu einer Gentransfektion.
- Ziehen Sie die Pipette vorsichtig etwa 100 μm von der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben.
- Legen Sie erneut einen positiven Druck an, um sicherzustellen, dass der Widerstand mit der in Schritt 5.5 aufgezeichneten Anzeige übereinstimmt, und nähern Sie sich dann der nächsten Zelle.
- Beseitigen Sie mögliche Verstopfungen, die visuell oder durch einen deutlich erhöhten (>15 % höheren) Pipettenwiderstand nach der Elektroporation angezeigt werden, indem Sie Überdruck ausüben.
Anmerkung: Wenn keine sichtbare Verstopfung vorhanden ist und der Widerstand immer noch deutlich höher ist, entsorgen Sie die Pipette und verwenden Sie eine neue. Im Durchschnitt kann eine Pipette für bis zu 20 Elektroporationsereignisse verwendet werden, wenn der Benutzer vorsichtig ist.
Nach der Elektroporation die Scheibenkultur auf einen frischen Kultureinsatz überführen und bis zu 3 Tage bei 35 °C im Inkubator inkubieren.
