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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Entnahme von Rückenmark
HINWEIS: Alle Instrumente sollten aus Gründen der Sterilität autoklaviert werden (135 °C und 30 psi für 4 x 7 min Zyklen).
- Euthanasieren Sie 1–3 Tage alte C57BL/6 Mäusebabys in einer Kammer mit Isofluran. Warten Sie 30 s nach Beendigung der Bewegung und kneifen Sie das Bein, um eine mangelnde Reaktion zu bestätigen.
- Trennen Sie den Kopf mit einer Schere vom Körper, wobei sich der Welpe in Bauchlage befindet.
- Stabilisieren Sie die Hinterbeine oder den Schwanz und die Arme auf dem Behandlungstisch, wobei die Rückenseite dem Benutzer zugewandt ist.
- Schneiden Sie die Haut mit einer gebogenen Irisschere ab.
- Schneiden Sie das Rückenmark aus der Lendenwirbelsäule direkt über den Hüften ab und schneiden Sie beide Seiten des Brustkorbs, um ihn vom Körper zu trennen.
Anmerkung: Dies erfordert eine sorgfältige Trennung des Rückenmarks von den viszeralen Organen, um eine versehentliche Schädigung anderer Organe zu vermeiden (Abbildung 1a).
- Nacheinander 10 s lang in 3 x 10 cm Petrischalen waschen, die 5 ml filtersterilisierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) von 0,2 μm enthalten, um überschüssiges Gewebe zu entfernen.
- Führen Sie eine 22G-Nadel und eine Spritze, die mit 5 ml filtersterilisiertem PBS gefüllt sind, in das kaudale Ende der Wirbelsäule ein und spülen Sie sie nach vorne, so dass der Strang in eine vierte Petrischale austreten kann (Abbildung 1b).
- Entnehmen Sie das Rückenmark in einem 15-ml-Röhrchen mit 5 mL HABG (Tabelle 1) auf Eis. Seien Sie vorsichtig, um eine Quetschung des Rückenmarks zu vermeiden.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.1 bis 1.8 für jedes Jungtier im Wurf.
Anmerkung: Im Idealfall sollte dieser Prozess weniger als 30 Minuten pro Rückenmark dauern, um eine gesunde Neuronenisolierung zu gewährleisten.
>2. Isolieren von Neuronen
HINWEIS: Der folgende Schritt sollte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Vertrautheit mit der grundlegenden sterilen Technik wird erwartet.
- Zerkleinerung von Gewebe
- Nehmen Sie den Schlauch mit dem Rückenmark und schütteln Sie ihn leicht, um das Gewebe aufzuhängen.
- Gießen Sie das Gewebe aus dem Röhrchen in eine 60 mm große Petrischale aus Glas und würfeln Sie mit einer Rasierklinge, um feine Stücke mit einer Größe von ~0,5 mm zu erhalten.
- Übertragen Sie das Gewebe mit einer Pipette mit breiter Bohrung in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 mL HABG.
- Legen Sie es für 30 Minuten in ein 30 °C heißes Wasserbad, damit sich die Zellen bei dieser Temperatur ausgleichen können. Bewahren Sie die Zellen gerade so weit auf einem Schüttler auf, dass sie in der Flüssigkeit schweben können.
Anmerkung: Dieser Schritt wird durchgeführt, um einen Schock der Zellen beim Übergang vom Eis in das Verdauungsmedium zu vermeiden. Die Zellen bei 30 °C zu halten, trägt dazu bei, den Zelltod zu verringern, der mit einem ansonsten erhöhten Stoffwechsel bei 37 °C verbunden ist.
- Bereiten Sie das Aufschlussmedium vor (Tabelle 1).
- Bereiten Sie den Dichtegradienten vor (Tabelle 1).
- Bereiten Sie jede der 4 Schichten in 4 separaten 15-ml-Röhrchen vor, wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Geben Sie 1 ml von jeder Schicht in ein neues 15-ml-Röhrchen. Beginnen Sie mit Schicht 1 unten und fügen Sie sie nacheinander hinzu, bis Sie oben Schicht 4 erreichen. Vermeiden Sie es, die Schichten beim Hinzufügen zu stören.
- Waschen Sie die PDL-beschichteten Platten. Waschen Sie sich einige Minuten lang mit sterilem Wasser, bevor Sie das restliche Wasser entfernen und 1 Stunde trocknen lassen.
- Übertragen Sie das Gewebe in das Verdauungsmedium.
- Nehmen Sie das gewebehaltige Röhrchen bei 30 °C aus dem Wasserbad des Schüttels und lassen Sie es einige Minuten einwirken.
- Nehmen Sie den Aufschlussmittelschlauch aus dem 37 °C warmen Wasserbad und aspirieren Sie ihn in eine Leur-Lock-Spritze.
- Saugen Sie das überschüssige HABG aus dem gewebehaltigen Röhrchen ab.
- Verwenden Sie einen 0,2-μm-Filter mit Leur-Lock auf der Spritze, um dem gewebehaltigen Röhrchen Verdauungsmedium zuzuführen.
- Legen Sie den Schlauch für 30 Minuten in ein 30 °C heißes Wasserbad. Lassen Sie die Zellen gerade so weit zittern, dass sie in der Flüssigkeit schweben können.
Anmerkung: Es ist wichtig, die Zellen nicht zu lange im Verdauungsmedium zu halten oder die Temperatur zu hoch werden zu lassen, was zu einer übermäßigen Verdauung führen und dazu führen kann, dass das Gewebe in einer gallertartigen Mischung suspendiert wird.
- Während dieser Zeit das Laminin beschichten.
- Führen Sie eine Verreibung durch (d. h. trennen Sie die Zellen vom Gewebe).
- Nehmen Sie den Schlauch aus dem schüttelnden 30 °C warmen Wasserbad und lassen Sie ihn einige Minuten einwirken.
- Überschüssiges Aufschlussmedium aspirieren.
- Suspendieren Sie das Gewebe in 2 mL HABG.
- Mit einer Pipette mit schmaler Bohrung 10x für 45 s.
Anmerkung: Dies ist wahrscheinlich der wichtigste Schritt und kann die Ausbeute erheblich verringern, wenn es nicht richtig gemacht wird.
- Aspirieren Sie das Gewebe in die Pipette und entleeren Sie den Inhalt sofort zurück.
- Vermeiden Sie das Einbringen von Luft, da dies die rentable Ausbeute erheblich verringert.
Anmerkung: Die ideale Pipette ist eine 9" Glaspipette. Die Spitze der Pipette sollte feuerpoliert werden, um raue Oberflächen zu glätten. Es sollte dann silikonisiert werden, indem Dichlordimethylsilan (DMDCS) in Chloroform in eine 1:20-Lösung gegeben und O/N belassen wird. Anschließend sollte die Pipette herausgenommen und an der Luft trocknen gelassen werden. Anschließend sollte es zur Sterilisation autoklaviert werden.
Vorsicht: DMDCS und Chloroform sind leicht entzündlich, und die Silikonisierung sollte in einem Abzug durchgeführt werden.
- Aspirieren Sie die oberen 2 mL des Überstands und geben Sie es in ein neues 15-ml-Röhrchen mit der Bezeichnung "Sammlung".
- Wiederholen Sie die Schritte 2.7.3 bis 2.7.5 zwei weitere Male (das Zellentnahmeröhrchen sollte am Ende 6 ml enthalten).
- Der Inhalt des Auffangröhrchens wird langsam in das in Schritt 2.2 vorbereitete Gradientenröhrchen überführt, wobei eine Störung des Gefälles vermieden wird.
- Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt das zuvor vorbereitete neurobasale Medium (Tabelle 1) aus dem Kühlschrank und lassen Sie es in einem 37 °C heißen Bad erwärmen.
- Reinigen Sie die Neuronen.
- Das Gradientenröhrchen 15 min bei 800 x g und 22 °C zentrifugieren.
- Entnehmen Sie die gewünschte(n) Schicht(en) mit einer Pipette (Abbildung 2) und setzen Sie sie in ein neues 15-ml-Röhrchen ein. Für die reinste Neuronenisolierung (d. h. >90 %) sammeln Sie Schicht 3. Für eine höhere Ausbeute bei geringerer Reinheit (d. h. >70–80 %) sammeln Sie die Schichten 2 und 3.
- Verdünnen Sie den Dichtegradienten, indem Sie den neu gesammelten Schichten 5 mL HABG hinzufügen.
- Bei 200 x g für 2 min bei 22 °C zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ihn in 5 ml HABG und schnippen Sie das Pellet, um die Zellen zu suspendieren.
- Bei 200 x g für 2 min bei 22 °C zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ihn in 3 ml neurobasalem Medium und schnippen Sie das Pellet, um die Zellen wieder zu resuspendieren.
Medien
| Medien | Lagerung | Zutaten | Präparat |
| HABG | 4 °C/24h | | 100 ml | - B27 in 4 °C Kühlschrank auftauen O/N
- Filter sterilisieren (0,22 μm) |
| Winterschlaf A | 97,8 ml |
| B27 [2 %] | 2 ml |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml |
| Neurobasale Medien | 4 °C/1 Woche | | 100 ml | - B27 in 4 °C Kühlschrank auftauen O/N
- Filter sterilisieren (0,22 μm)
- Aliquotieren Sie 50 mL-Portionen in 50-ml-Röhrchen (bei 4 °C lagern) |
| Neurobasal A | 97 ml |
| B27 [2 %] | 2 ml |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml |
| Stift/Streptokokken [1 %] | 1 ml |
| Aufschluss | Tag der Isolation | | 10 mL | - kräftig schütteln
- 30 min in einem 37°C heißen Bad ziehen lassen (idealerweise 30 min vor Gebrauch zubereiten)
- Filter sterilisieren (0,22 μm) |
| HA-CA | 10 mL |
| Papain | 25 mg |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 ml |
| Dichtegradient | Tag der Isolation | | >1 Farbverlauf | |
| Schicht | OptiPrep | HABG |
| (0,13 ml) | (5,29 ml) |
| 1 Unterseite | 0,26 mL | 1,24 mL |
| arabische Ziffer | 0,19 mL | 1,31 mL |
| 3 | 0,15 mL | 1,35 mL |
| 4 Nach oben | 0,11 mL | 1,39 mL |
Tabelle 1: Vorbereitung der Medien und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.
