Dezellularisierung des kardiopulmonalen Komplexes: Eine Technik zur Dezellularisierung von Herz und Lunge aus dem Mausmodell

Abstract

Quelle: Mayorca-Guiliani, A. E. et al. Dezellularisierung des kardiopulmonalen Komplexes der Maus. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Herstellung von dezellularisierten extrazellulären Matrix- oder EZM-Gerüsten durch Anwendung einer antegraden Perfusion von Detergenzien durch das Gefäßsystem. Die strukturellen ECM-Gerüste können dann verwendet werden, um den ECM-Umbau im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen zu analysieren.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Postmortale Mikrochirurgie

1. Euthanasieren Sie die Maus mit einer CO₂ -Kammer.
   1. Setzen Sie die Maus in eine 4-Liter-Kammer und beginnen Sie, sie mit 100 % CO_{2 zu} füllen, beginnend bei 0,2 l/min für 2 Minuten, und steigern Sie sie, bis nach 3 Minuten ein Durchfluss von 0,8 l/min erreicht ist. Die Maus sollte während der ersten 2 Minuten bewusstlos werden, und dann sollte die Atmung aufhören (normalerweise etwa 5 Minuten, aber der Fluss kann bei Bedarf aufrechterhalten werden). Bestätigen Sie den Tod, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
2. Brustkorb, Bauch und Rücken der Maus mit dem Haarschneider rasieren und mit 70% Ethanol desinfizieren. Durch die Rasur wird die Anzahl der Artefakte aufgrund des Vorhandenseins von Haaren auf Proben für die Bildgebung oder die biochemische Analyse stark reduziert.
3. Stecken Sie die Maus an eine Styroporschale und strecken Sie dabei ihre Vorder- und Hintergliedmaßen sowie ihren Kopf und Schwanz aus. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop.
4. Mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster wird ein chirurgischer Zugang mit einem Hautschnitt hergestellt, der von der submandibulären Region bis zum Unterbauch verläuft, und subkutan präpariert, um die Thoraxwand und das Peritoneum freizulegen.
5. Schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere den Musculus pectoralis major und den Musculus pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand ab.
6. Schneiden Sie mit einer geraden Schere das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte und führen Sie dann eine Sternotomie durch, indem Sie das Brustbein entlang seiner Längsachse schneiden, dann beide Seiten der Brustwand anheben und feststecken, um den Herz-Lungen-Komplex freizulegen.
Entfernen Sie
7. mit einer Mikrozange mit runder Spitze (oder Dumont-Mikrozange) den Thymus und das umgebende Fettgewebe, indem Sie sie vorsichtig von ihren Befestigungen abziehen. Dadurch werden die wichtigsten Schiffe angezeigt.
8. Mit dem Kauter die absteigende Cava-Vene kauterisieren und mit einer geraden Schere die Speiseröhre durchtrennen.
9. Trennen Sie mit einer scharfen Mikrozange die Venen brachiocephalica und die Arteria brachiocephalic, die linke Arteria carotis communis und die Arteria subclavia vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern.
10. Mit einem Mikronadelhalter, einer scharfen Mikrozange und einer Naht 9-0 werden die Stiche oberhalb des Austritts der Arteria brachiocephalic, der linken Halsschlagader und der linken Arteria subclavia platziert.
11. Verätzen Sie die brachiozephalen Venen.
12. Trennen Sie die submandibulären Speicheldrüsen entlang der Mittellinie, um die Nackenmuskulatur und die Luftröhre freizulegen. Trennen Sie die Muskeln, um das Cricothyreoidband freizulegen. Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band durchtrennen.
13. Führen Sie einen 27-G-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie ihn vorsichtig an, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt (d. h. bis der Widerstand gegen den Katheter erreicht ist, dann ziehen Sie sich 3 mm zurück). Achten Sie darauf, die Bronchien nicht zu stören. Legen Sie mit einer 6-0-Naht 3 Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.
14. Schnitt der Maus auf Höhe des 12. Brustwirbels. Die absteigende Aorta verläuft anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule durchtrennt werden. Die untere Hälfte auseinander setzen.
15. Katheterisieren Sie die Aorta retrograde und schieben Sie den Katheter bis zum Aortenbogen. Mit der Naht 9-0 4 Stiche um die Aorta legen, beginnend 5 mm unterhalb der Katheterspitze.

>2. Dezellularisierung

1. Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und Luer-Anschlüsse an ein Pumpensystem an. Perfusion mit entionisiertem Wasser bei 200 μL/min für 15 min. Halten Sie diese Durchflussrate während der Dezellularisierung aufrecht.
2. Wechseln Sie das Perfusionsmittel auf 0,5 % Natriumdesoxycholat (DOC), das in entionisiertem Wasser verdünnt und über Nacht perfundiert wird.
3. Wechseln Sie das Perfusionsmittel auf 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), das in entionisiertem Wasser verdünnt und 8 Stunden lang perfundiert wird.
4. Über Nacht mit entionisiertem Wasser durchströmen, um SDS und DOC 24 h lang wegzuspülen.
5. Das dezellularisierte Herz und die Lunge werden resektioniert, indem die Ansätze am Thorax mit einer gebogenen Schere durchtrennt werden, und in einem sterilen Kryoröhrchen mit deionisiertem Wasser mit 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin und 0,3 μM Natriumazid bei 4 °C gelagert. ECM-Gerüste können mindestens 12 Wochen gelagert werden. Wenn das Gerüst für biochemische Analysen (z. B. Massenspektrometrie) verwendet wird, frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikrochirurgie
6-0 Naht, Nadel mit dreieckigem Schnitt (Vicryl)	Ethikon	6301124
9-0 Mikronaht (Safil)	B Braun	G1048611
Adson-Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11006-12
Adson-Pinzette mit Zähnen	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11027-12
Castroviejo Mikronadelhalter	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 12061-01
CO2-Beatmungskammer für die Euthanasie von Mäusen
Deionisiertes Wasser (Milli-Q IQ 7000, Reinstwassersystem für Labor)	Merck	ZIQ7000T0
Einweg-Tablett aus Polystyrol (~30 × 50 cm)
Präpariermikroskop (Greenough, mit zweiarmigem Schwanenhals)	Leica	S6 D
Doppelseitiger Mikroskopspatel	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 10091-12
Dumont Mikrozange (zwei)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11252-20
Dumont Mikrozange mit 45° Spitzen	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11251-35
Haarschneider	Oster	Tel.: 76998-320-051
Halsey Nadelhalter (mit Wolframkarbidbacken)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 12500-12
Intravenöser 24-Gauge-Katheter (Insyte)	Bd	381512
Intravenöser 26-Gauge-Katheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo-Schere (harter Schnitt, gerade)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14110-15
Mikrozange mit ringförmigen Spitzen	Äskulap	FM571R
Mikro-Federschere (Vannas, gebogen)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 15001-08
Nadeln (27 Gauge; Mikrolanze)	Bd	Nr. 21018
Papiertuch (steril) oder chirurgische Serviette
Gezahnte Schere (CeramaCut, gerade)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14958-09
Pfannenwender (Freer-Yasargil)	Äskulap	OL166R
Spritzen (1 mL; Plastipak)	Bd	3021001
Spritzen (10 mL; Plastipak)	Bd	3021110
Sehnenschere (Walton)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14077-09
DEZELLULARISIERUNG
70 % Ethanol (absoluter Alkoholgehalt 99,9 %); absoluter Alkoholgehalt muss mit entionisiertem Wasser auf 70 % (vol/vol) eingestellt werden	Pflaume	1680766
Deionisiertes Wasser (Milli-Q IQ 7000, Reinstwassersystem für Labor)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-zu-Schlauch-Außengewinde (1/8 Zoll)	Welt Präzisionsinstrumente	Nr. 13158-100
Luer-zu-Schlauch-Außengewinde (1/8 Zoll)	Welt Präzisionsinstrumente	Nr. 13158-100
PBS (pH 7,4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Schlauchpumpe (mit 12 Kanälen)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silikonschlauch (mit 2 mm Innendurchmesser und 4 mm Außendurchmesser)	Ole Dich	Artikel-Nr.: 31399
Natriumazid	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Natriumdesoxycholat (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G