Isolierung von zirkumvallaten Papillen (CVP) Epithel aus Mausmodell: Ein enzymatisches Verfahren zur Trennung von CVP-Epithel aus der Mauszunge

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Shechtman, L. A. et al. Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden, die aus adulten Stammzellen des Mausgeschmacks gewonnen wurden. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video beschreiben wir die Isolierung von zirkumvallaten Papillen (CVP) Epithel aus einer Mauszunge.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Isolierung des CVP-Epithels

Euthanasieren Sie die Mäuse mit CO₂ -Erstickung gemäß den IACUC-Vorschriften, gefolgt von einer zugelassenen sekundären Methode wie bilateraler Thorakotomie, Gebärmutterhalsluxation, Enthauptung oder Exsanguination.
Verwenden Sie eine große, sterile Präparierschere, um die Wangen zu schneiden und den Kiefer zu brechen. Heben Sie die Zunge an und schneiden Sie das Zungenbändchen, um die Zunge vom Boden der Mundhöhle zu trennen. Schneiden Sie die Zunge heraus und sammeln Sie sie in steriler, eiskalter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (dPBS) mit Ca²⁺ und Mg²⁺.
Entfernen und entsorgen Sie die vordere Zunge, indem Sie mit einer Rasierklinge nur den vorderen Teil der intermolaren Eminenz abschneiden (Abbildung 1A, gestrichelte Linie). Verwenden Sie ein sanftes Tuch, um Haare und überschüssige Flüssigkeit von der hinteren Zunge zu entfernen.
Füllen Sie 1 ml-Spritze mit 200–300 μl Injektionsenzymlösung (Endkonzentration: 2 mg/mL Typ-I-Kollagenase und 5 mg/ml Dispase II in Ca²⁺/Mg²⁺-haltiges dPBS, verdünnt aus 10 mg/ml-Stammlösungen) und führen Sie eine 30 G x 1/2 Nadel knapp über der intermolaren Eminenz ein (Abbildung 1B, schwarzer Pfeil) bis knapp vor dem ZVP (Abbildung 1B, schwarzer Kasten). Injizieren Sie die Enzymlösung unterhalb und an den lateralen Rändern des ZVP zwischen dem Epithel und dem darunter liegenden Gewebe (Lamina propria, Muskel). Ziehen Sie die Spritze langsam und kontinuierlich von der Zunge zurück, während die Injektion durchgeführt wird.
Inkubieren Sie die Zunge in sterilem Ca²⁺/Mg²⁺-freiem dPBS bei Raumtemperatur für genau 33 min.
Machen Sie mit einer extra feinen Dissektionschere beidseitig und knapp vor dem ZVP kleine Schnitte im Epithel und schälen Sie das Epithel vorsichtig, indem Sie es mit einer feinen Pinzette anheben. Sobald das Grabenepithel vom darunter liegenden Bindegewebe befreit ist, legen Sie es in ein leeres 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit FBS vorbeschichtet ist. Führen Sie die Epitheltrimmung vor oder nach der Ablösung des ZVP-Epithels durch (Abbildung 1C, D).

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Präparierte Zunge und geschältes ZVP-Epithel. (A) Die Zunge wird präpariert und die vordere Zunge wird entfernt, indem knapp vor der intermolaren Eminenz (gestrichelte Linie) geschnitten wird, wobei die hintere Zunge, die den ZVP enthält, übrig bleibt (Black Box) (B) Eine Nadel wird knapp vor der intermolaren Eminenz (schwarzer Pfeil) ...