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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Mikroblasen
- Vorbereitung von Mikrobläschen für die Injektion
Anmerkung: Der Assistent führt diesen Schritt aus, wenn mit der "Injektion von Mikrobläschen (MB) in Embryonen" begonnen wird. Jeder Embryo wird einmal injiziert, wobei die Art der Mikroblase, die für jede Injektion ausgewählt wird, vom Assistenten nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wird, so dass alle Arten von Mikrobläschen gleichmäßig über den Eingriff verteilt sind, aber in einer zufälligen Reihenfolge. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg blind für die Art der Blase ist, die injiziert wird.
- Bestimmen Sie das Volumen der Stammblasenlösung, das erforderlich ist, um eine Endkonzentration von 1 x 108 MB/ml in einem Volumen von 400 μl zu erzeugen (berechnen Sie das Volumen anhand der Stammkonzentrationen). Aliquotieren Sie das entsprechende Volumen an Kochsalzlösung in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen.
- Rühren Sie das ausgewählte Mikroblasenfläschchen vorsichtig um und ziehen Sie ein überschüssiges Volumen (~50 μl größer als das oben berechnete) der Lösung mit der 21-g-Nadel in eine 1-ml-Spritze. Injizieren Sie die Mikrobläschen in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Mikroblasen-Stammlösung und fügen Sie es dem Aliquot der Kochsalzlösung hinzu. Mischen Sie durch leichtes Rühren mit der Spitze der Pipette.
- Ziehen Sie die verdünnte Mikroblasenlösung mit der 21-G-Nadel in eine saubere Spritze. Entfernen Sie die Nadel, entfernen Sie alle Luftblasen von der Spritze und befestigen Sie den Luer und den Schlauch. Schieben Sie die Lösung langsam bis zum Ende des Schlauchs und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen.
- Führen Sie die Spritze in ein Spritzeninfusionspumpenset ein, um die Mikrobläschen mit einer Geschwindigkeit von 20 μl/min für ein Gesamtvolumen von 20 μl abzugeben. Befestigen Sie eine gezogene Glasnadel am Ende des Schlauchs. Bewegen Sie die Pumpe in die Nähe der Einspritzstufe.
>2. Injektion von Mikrobläschen in Embryonen
- Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip einen Embryo aus und nehmen Sie ihn (mit einem perforierten Löffel) aus der Schale mit gekühltem Medium. Legen Sie es in eine Präparierschale, die sich auf dem Ultraschalltisch unter dem Stereoskop befindet, und entfernen Sie den Dottersack und die Fruchtwasserhäute mit der feinen Pinzette, indem Sie von der Seite schneiden/reißen, die am wenigsten vaskularisiert erscheint (die antimesometriale Seite). Dies gelingt am einfachsten, indem man einen Bereich durchsticht, der an die Kopfregion angrenzt.
- Schneiden Sie genug, um den Embryo von innen heraus zu entfernen, aber nicht mehr. Stabilisieren Sie die Präparierschalen mit kleinen Knetstücken.
- Manövriere den Sack vorsichtig um den Embryo herum. Positionieren Sie den Embryo auf der Seite, mit der Plazenta und den Nabelgefäßen vorne. Stecken Sie mit den Insektennadeln den Dottersack (4 Stecknadeln empfohlen) und die Ränder der Plazenta nach Bedarf fest, um sie zu befestigen. Vermeiden Sie große Schiffe.
- Waschen Sie den Embryo mit vorgewärmtem PBS bei 45 °C, bis der Embryo wieder auflebt. Identifizieren Sie die Nabelvene und das zugehörige Gefäßnetzwerk. Positionieren Sie die Schale so, dass die Injektion bequem durchgeführt werden kann.
Anmerkung: Nach der Erwärmung beginnt das Blut im Embryo zu fließen und pumpt sichtbar in die Nabelarterie. Wenn der Fluss zum ersten Mal beginnt, sind die Venen hellrot, wobei das Blut in beiden Gefäßen schnell identisch erscheint. Die Äste, die aus der Nabelvene entspringen, überlagern in der Regel die Äste der Nabelschnur auf der Plazentaoberfläche.
- Sobald der Embryo wiederbelebt ist, bedecken Sie ihn (aber nicht die Plazenta) mit vorgewärmtem US-Gel und achten Sie darauf, alle Luftblasen vorsichtig (mit der feinen Pinzette) um den Embryo herum zu entfernen. Füllen Sie das Gericht mit vorgewärmtem PBS auf.
Anmerkung: Behalten Sie den Lösungsstand in den PBS- und Gelspritzen im Auge und geben Sie bei Bedarf Ersatzspritzen in das Heizbecherglas.
- Montieren Sie die Glasnadel auf einer großen Plastilinkugel am Rand der Sezierschale und führen Sie das Nadelende in das PBS ein. Wählen Sie eine Vene auf der Chorionoberfläche der Plazentascheibe, die so weit wie möglich vom Hauptast entfernt ist, und schneiden Sie die Spitze mit einer Schere zurecht. Die Injektion ist am einfachsten, wenn die Spitze leicht schräg geschnitten wird. Entfernen Sie alle gezackten Kanten des Glases mit der Kante der Federschere.
- Injizieren Sie die Mikroblasenlösung mit der Spritzenpumpe langsam mit 20 μl/min in die Glasnadel, bis die gesamte Luft aus der Nadelspitze ausgestoßen ist und die Mikrobläschen ungehindert in das PBS fließen. Stoppen Sie die Pumpe und stellen Sie sie auf ein Injektionsvolumen von 20 μl zurück. Lassen Sie während der Injektion keine Luft in das Gefäßsystem des Embryos eindringen.
- Führen Sie die Glasnadelspitze vorsichtig in eine der Venen in der Plazenta ein und stellen Sie sicher, dass sie unbeweglich ist. Schwenken Sie den Stereoskopkopf weg und positionieren Sie den Schallkopf über dem Embryo. Initiieren Sie die Bildgebung.