Tupferbasierte Isolierung von konjunktivalen kommensalen Bakterien: Eine Technik zur Isolierung kommensaler Bakterien aus der Bindehaut des Mausmodells

Zusammenfassung

Quelle: Smith-Page, K. et al. Konjunktivale kommensale Isolierung und Identifizierung bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video beschreibt eine auf Abstrichen basierende Technik, um lebensfähige kommensale Bakterien aus der okulären Bindehaut zu isolieren. Die Technik kann verwendet werden, um ein Profil des kommensalen bakteriellen Mikrobioms der Bindehaut zu erstellen, das eine defensive Rolle gegen Krankheitserreger spielt.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung von Augenabstrichen, Einrichtung des Arbeitsfeldes, Abstrich von Mausaugen und Probenanreicherung

1. Sterile Augentupfer vorbereiten
   Anmerkung: Sterile Augentupfer sind dünn beschichtete Zahnstocher aus Holz, die mit einer faserdünnen Schicht aus Baumwollwatte versehen und im eigenen Haus hergestellt werden.
   1. Autoklavieren Sie die entsprechende Menge Watte und Zahnstocher für die Anzahl der abzutupfenden Mäuse.
   2. Ein halbes Zentimeter langes Stück Watte mit Daumen und Zeigefinger abkneifen. Ziehen Sie die Watte heraus, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger an den Rändern ziehen, um eine flache, einporige Schicht zu bilden, die kurz vor dem Zerfallen der Watte aufhört (kleine Wattestücke, die in der gedehnten Watte verteilt sind, sind akzeptabel).
   3. Wirbeln Sie das Vlies um eines der scharfen Enden des Zahnstochers, indem Sie das ausgestreckte Stück leicht auf die Zahnstocherspitze halten, während es gedreht ist, siehe Abbildung 1. Der "fertige" Augentupfer besteht aus einer sehr dünnen Schicht Baumwolle, die über die Spitze gespannt ist und sich etwa einen halben bis einen Zentimeter von der Spitze entfernt erstreckt.
   4. Die "fertigen" Tupfer mit der Tupfer nach unten in ein kleines Becherglas geben und abdecken. Autoklav.
2. Einrichten des Arbeitsbereichs
   1. Bereiten Sie eine Anästhesie vor, die 2 ml Ketamin (100 mg/ml), 400 μl Xylazin (100 mg/ml) und 27,6 ml sterile Kochsalzlösung (0,9 % NaCl in dH₂O) in einem sterilen sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen enthält. Filtersterilisation und aliquote Anästhesie für den sofortigen Gebrauch (kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden; vor der Verwendung immer auf Raumtemperatur ausgleichen lassen).
   2. Reinigen und reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionsmittel, um Kontaminationen zu minimieren.
   3. 0,5 ml steriles Hirn-Herz-Infusionsmedium (BHI) in markierte sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren (1 Röhrchen pro Maus und Kontrolle); in einem Mikrozentrifugengestell anordnen. Stellen Sie das Gestell auf Eis.
   4. Richten Sie den Arbeitsablauf wie folgt ein (von links nach rechts): Maus-Anästhesiestation (Käfig mit Versuchsmäusen, leerer steriler Käfig, Anästhesie bei Raumtemperatur, 25 G Nadel und 1 mL Spritze), Augenabstrichstation (aliquotiertes BHI auf Eis, sterilisierte Augenabstriche, saubere Papiertücher, 70 % Isopropanol-Spray) und Plattierungsstation (Blutagarplatten bei Raumtemperatur, 10 μl Pipette, 10 μl sterile Einwegspitzen, Behälter für biologisch gefährliche Abfälle).
3. Augenabstrich
   1. Verabreichen Sie jeder erwachsenen Maus 10 μl Anästhesie pro 1 g Gewichtsdosis der Maus von Ketamin bzw. Xylazin intraperitoneal und legen Sie sie in einen autoklavierten Käfig. Testen Sie die Anästhesie, indem Sie das Hinterfußpolster zusammendrücken; Keine Bewegung deutet auf eine angemessene Anästhesie hin.
   2. Weisen Sie eine Hand nur für den Umgang mit anästhesierten Mäusen und die andere Hand nur für den Augenabstrich und die Kultur zu. Nehmen Sie zum Abtupfen die vollständig betäubte Maus aus dem Käfig; Legen Sie es mit dem linken Auge auf die saubere Arbeitsfläche, die auf der Seite liegt. Besprühen Sie die behandschuhten Hände mit Isopropanol und trocknen Sie sie mit einem sauberen Papiertuch ab.
   3. Entdeckeln Sie das speziell beschriftete BHI-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer speziellen Hand für die Medienhandhabung. Setzen Sie das Röhrchen wieder in das Mikrozentrifugengestell auf Eis ein. Tauchen Sie die mit Watte überzogene Spitze des Augentupfers in BHI, ziehen Sie den Augentupfer aus dem Röhrchen und schwenken Sie die Spitze 2 Mal gegen den Innenschlauch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
   4. Halten Sie die Maus mit der Maus vorsichtig am Nacken. Legen Sie mit der anderen Hand die Spitze des Augentupfers gegen die mediale Bindehautregion des linken Auges, siehe Abbildung 2A. Drücken Sie den Augapfel leicht nach unten und bewegen Sie den Tupfer in einer Fensterputzbewegung (Abbildung 2B) 10 Mal zwischen Unterlid und Auge hin und her. Halten Sie den Druck konstant.
   5. Entfernen Sie, ohne das Fell zu berühren, vorsichtig die Spitze des Tupfers senkrecht zur Stelle, an der er eingeführt wurde, und legen Sie den Tupfer mit der Watteseite nach unten direkt in ein beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen mit BHI-Medien. Tragen Sie einen befeuchtenden Augentropfen auf das abgestrichene Auge auf.
   6. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein.
   7. Lassen Sie den Tupfer 10 bis 15 Minuten auf Eis stehen und entfernen Sie den Augentupfer mit der sterilisierten behandschuhten Hand, indem Sie die Spitze 10 Umdrehungen lang mit dem Medium mischen. Ziehen Sie den Tupfer heraus, indem Sie die Spitze 5 Umdrehungen lang gegen die Innenwand des Mikrozentrifugenröhrchens schwenken. Entsorgen Sie den Tupfer in einem Behälter für biologische Gefahren.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 bis 1.3.7 für jede Maus und für Kontrollproben (Haut- oder Fellabstrich). Sterilisieren Sie die Handschuhe zwischen jedem Tupfer entsprechend.
4. Anreicherung
   1. Reichern Sie die Probe an, indem Sie das Röhrchen 1 h lang bei 37 °C statisch inkubieren
   2. Während der Inkubation wird ein Trypticase-Soja bei Raumtemperatur mit 5 % Schafblut-Agarplatte (TSA-Platte) pro Maus beschriftet und in zwei Hälften geteilt.
   3. Nach der Inkubation der Augenabstrichkultur angereicherte Proben aus dem Inkubator entnehmen und auf Eis legen.
   4. Proben kurz vortexen, mischen, und plattieren Sie sie gemäß dem Schema in Abbildung 3A. Aliquotieren Sie 10 μl der Probe auf die TSA-Platte und kippen Sie die Platte, um einen Streifen zu bilden, wiederholen Sie den Vorgang 2 Mal.
   5. Auf der anderen Seite der Trennlinie der Platte 10 μl Probe auf Agar tupfen, 9 Mal wiederholen.
   6. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 18 Stunden, 2 Tage und 4 Tage (in einer sauberen Kammer, die ein Austrocknen der Agarplatten verhindert). Zählen Sie Kolonien in Streifen, notieren Sie die Morphologie und berechnen Sie koloniebildende Einheiten (KBE) pro Tupfer für morphologisch ähnliche Isolate. Schauen Sie sich Punkte für einzigartige Organismen an, die nicht in Streifen erfasst sind.

Ergebnisse

Abbildung 1: Inhouse-Augenabstrich.
(A) Ein dünnes, etwa 1 cm langes Stück gezogene Watte wurde zwischen der sterilen Zahnstocherspitze und dem Zeigefinger gehalten, und der Zahnstocher wurde unter leichtem Druck auf den Zeigefinger gerollt, bis die Watte vollständig auf die Zahnstocherspitze gerollt war. (B) Beispiel für einen Augenabstrich.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,1 bis 10 μl Pipettenspitze	USA Wissenschaftlich	Nr. 1110-300	Vor Gebrauch autoklavieren
0,5 bis 10 μl Eppendorf-Pipette	Fisher Scientific	Tel.: 13-690-026
1 ml Spritze	Fisher Scientific	BD309623	1 Spritze für jede Augenabstrichergruppe
1,5 ml Eppendorf Tuben	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1615-5500	Vor Gebrauch autoklavieren
1000 μ ml Pipettenspitze	USA Wissenschaftlich	Nr. 1111-2021	Vor Gebrauch autoklavieren
200 bis 1000 μl Gilson Pipettierer (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G Nadel	Fisher Scientific	Nr. 14-826AA	1 Nadel pro Augenabstrichgruppe
3 % Wasserstoffperoxid	Fisher Scientific	Nr. S25359
37 ° C Inkubator	Laborausstattung
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injektion (Xylazin 100 mg/ml)	Santa Cruz Tiergesundheit	SC-362949Rx
Bunsenbrenner	Laborausstattung
Saubere Papierhandtücher	Laborausstattung
Baumwollwatte / Sterile gerollte Baumwolle	CVS
Ketamin (100 mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mäuse	Jackson Labore	C57/BL6J
Petrischalen	Fisher Scientific	Tel.: 08-757-12	Für Mannitol Salz Agar Platten
RPI Gehirn Herz Infusionsmedien	Fisher Scientific	Tel.: 50-488525	Bereiten Sie gemäß den Anweisungen vor und autoklavieren
SteriFlip (0,22 μm Porengröße, Polyestersulfon)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	Zur Sterilisation der Anästhesie
Steriler Mauskäfig	Laborausstattung
Zahnstocher (runder Bambus)	Küchen-Essentials		Autoklav vor Gebrauch und Tupfervorbereitung
Trypticase Soja-Agar II mit 5% Schafsblutplatten	Fisher Scientific	4321261	Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern
Augentropfen zum Einmalgebrauch	CVS Apotheke		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 Fläschchen, je 0,02 fl oz.

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