Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Lösungs- und Perfusionsapparaten
- Bauen Sie eine Langendorff-Apparatur mit konstantem Durchfluss (kommerziell erhältlich oder selbst gebaut) zusammen. Abbildung 1 zeigt ein einfaches Schema.
- Bereiten Sie die Lösungen gemäß den in Tabelle 1 und Tabelle 2 angegebenen Reagenzien vor.
- Schalten Sie das zirkulierende Wasserbad ein und stellen Sie eine geeignete Eingangstemperatur (42,7 °C in unserem Labor) ein, um sicherzustellen, dass der Ausfluss des Perfusatzirkulationssystems aus der Kanüle 37 °C erreicht.
- Reinigen Sie das Perfusionssystem, indem Sie entionisiertes Wasser zirkulieren lassen. Wenn ein steriler Zustand erforderlich ist, lassen Sie 75%iges Ethanol 15 Minuten lang durch das Perfusionssystem laufen, gefolgt von deionisiertem Wasser (mindestens 10 Zyklen, um Auswirkungen von Alkoholtoxizität auf das Herz zu vermeiden).
- Messen Sie die Zeit und das Volumen für einen Zyklus des Perfusatzirkulationssystems, um zu bestimmen, wie viele Milliliter sauerstoffhaltige Tyrodelösung im folgenden Perfusionsschritt geladen werden müssen.
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in der gewünschten Methode.
- Stellen Sie die Flussrate des Perfusatperfusionssystems auf 4 mL/min ein.
- Bereiten Sie zwei saubere 35-mm-Petrischalen vor – eine mit Tyrode-Lösung (Petrischale 1), die andere mit Lösung 1 (Petrischale 2).
- Bereiten Sie eine mit Lösung 1 gefüllte 1-ml-Spritze und eine 20-g-Kanülennadel aus stumpfem Stahl mit einer Kerbe vor, von der aus der Abstand 1 mm zur Spitze beträgt. Bereiten Sie einen losen Knoten mit 3-0 Naht zum Kanülenschaft vor. Regulieren Sie das Sichtfeld des Stereomikroskops und stellen Sie sicher, dass sich die Kanülenspitze unter der Flüssigkeitsoberfläche der Petrischale 2 befindet.
>2. Vorbereitung von Tieren
- Verabreichen Sie den Mäusen intraperitoneal Heparin (Konzentration, 1.000 IE/ml; 0,2 ml/Maus), um Blutgerinnsel zu vermeiden. Nach 10 Minuten betäuben Sie die Mäuse mit Natrium-Pentobarbital (50 mg/kg, i.P. Injektion) und stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht mehr auf Schwanz-/Zehenkneifungen reagieren. Führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation 20 Minuten nach der Verabreichung von Heparin durch.
- Bringen Sie die Mäuse auf die Operationsplattform, fixieren Sie die Mäuse in Rückenlage, sterilisieren Sie den Brustkorb mit 75% Ethanol und trocknen Sie ihn mit Gaze oder Serviette.
>3. Herzexzision und Aortenkanülierung
- Heben Sie die Haut des Xiphoids mit einer Gewebezange an und machen Sie mit einer Gewebeschere einen kleinen seitlichen Schnitt durch die Haut. Führen Sie eine stumpfe Dissektion zwischen Haut und Faszien durch und verlängern Sie den Schnitt der Haut V-förmig in Richtung der Achseln auf beiden Seiten.
- Setzen Sie die gleiche Schnittspur durch den Brustkorb fort und lenken Sie dann den Brustkorb nach oben, indem Sie das Brustbein mit einer Gewebezange festklemmen, um Herz und Lunge vollständig freizulegen.
- Ziehe das Perikard mit einer gebogenen Pinzette ab. Reißen Sie die Thymusdrüse mit zwei gebogenen Zangen zu beiden Seiten ab, wenn sie die großen Gefäße bedeckt. Ziehen Sie die Basis des Herzens mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig in Richtung Schwanz, bis ein "Y"-förmiges Blutgefäß (die Aorta und ihre Astarterien) zu sehen ist.
- Um unterschiedliche Längen der Aorta für die Kanülierung und den Vergleich zu reservieren, wird die Aorta an der linken Arteria carotis communis (grüne Linie in Abbildung 2) durchtrennt und bei einigen Mäusen gleichzeitig die Arteria brachiocephalica durchtrennt. Bei anderen Mäusen an der aufsteigenden Aorta transektieren (schwarze Linie in Abbildung 2).
Anmerkung: Für diejenigen, die neu in diesem Verfahren sind, kann dieser Schritt auch unter einem stereoskopischen Mikroskop durchgeführt werden.
- Schneiden Sie das Herz heraus und tauchen Sie es sofort in die Petrischale 1, um das Restblut zu waschen und abzupumpen.
- Übertragen Sie das Herz in die Petrischale 2 und schneiden Sie überschüssiges Gewebe bei Bedarf mit einer feinen Irisschere ab. Für diejenigen, die neu in diesem Verfahren sind, führen Sie diesen Schritt unter dem Stereomikroskop durch, um zu vermeiden, dass die Aorta oder andere Herzstrukturen versehentlich durchtrennt werden.
- Drücken Sie auf die Spritze, um Luftblasen auszustoßen, bevor Sie die Aorta kanülieren. Führen Sie eine retrograde Aortenkanüle mit Hilfe von zwei geraden Bindezangen (glatte Backen) unter dem Stereomikroskop durch. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Kanülenprozess unter der Flüssigkeitsoberfläche stattfindet.
- Vermeiden Sie es, in die Aortenklappen einzudringen, und passen Sie die Tiefen an die aufsteigende Aorta (die Maus, bei der die Aorta an der linken Halsschlagader durchtrennt wurde) bzw. die Aortenwurzel (die Maus, bei der die Aorta an der aufsteigenden Aorta durchtrennt wurde) an.
Anmerkung: Die Tiefe der Aortenkanülierung (einfach als Tiefe bezeichnet) wird hier definiert als die Position, an der sich die Kanülenspitze in der Aorta befindet oder an der die Aorta ligiert wird.
- Ligustieren Sie die Aorta mit der 3-0-Naht vor dem Knoten bis zur Kanülenkerbe. Drücken Sie vorsichtig auf den Inhalt der Spritze, um das Restblut zu spülen.
Anmerkung: Das Blut verlässt die Koronararterien und fließt aus den dorsalen Venen, wenn die Tiefe richtig positioniert ist. Das Herz und die Vorhofanhänge dehnen sich aus und werden blass.
- Entfernen Sie die Kanüle und schließen Sie sie an das Langendorff-Gerät an. Achten Sie auch hier darauf, dass keine Luftblasen in das Herz gelangen.
Anmerkung: Beachten Sie, dass die Zeit von der Thorakotomie bis zur ersten Perfusion 5 Minuten nicht überschreiten sollte.
- Für die Herzperfusion wird zunächst die sauerstoffhaltige Tyrode-Lösung für ca. 10 s grundiert und perfundiert (das Volumen der Flüssigkeit, die 10 s in dem in diesem Protokoll verwendeten System fließt, beträgt ca. 0,7 ml), wenn sich in den Vorhöfen Restblut befindet, und dann zu Lösung 1 wechseln. Perfundieren Sie jedoch einfach mit Lösung 1, wenn sich kein Restblut in den Vorhöfen befindet. Perfundieren Sie das Herz für ca. 2 Minuten.
Tabelle 1. Lösungen für die CM-Isolierung von Mäusen bei Erwachsenen.
| Lösung | Gehalte (Endkonzentration in mmol/L, falls nicht anders angegeben) | Verstanden |
| Perfusionslösung (Lösung 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurin, 5 Glukose, 10 2,3-Butandionmonoxim (BDM) | Das 3 Tage bei 4 °C gelagert werden kann. Glukose, Taurin und BDM werden am Tag des Versuchs hinzugefügt. Bereiten Sie 200 ml Perfusionslösung für jedes Herz vor. |
| Tyrodes Lösung (Lösung 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glukose | Das kann 3 Tage bei 4 °C gelagert werden. CaCl2 und Glukose werden am Tag des Experiments hinzugefügt, stellen Sie den pH-Wert auf 7,3-7,4 mit gesättigtem NaOH bei Raumtemperatur (28-30 °C) mit einem PH-Messgerät ein. |
Tabelle 2. Lösungen für die Isolierung und Lagerung von CM-Mäusen bei Erwachsenen.
| Lösung | Inhalt | Verstanden |
| Aufschlusslösung (Lösung 3) | 25 mL Lösung 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg Kollagenase II, 50μL (2,5 % 10×) Trypsin | Für jedes Herz |
| Stopp Lösung 1 (Lösung 4) | 9 mL Lösung 1, 1 mL FBS (Fötales Rinderserum), 4 μL 100 mM/L CaCl2 | Für jedes Herz |
| Stopp Lösung 2 (Lösung 5) | 9,5 mL Lösung 1, 0,5 mL FBS (Fötales Rinderserum), 4 μL 100 mM/L CaCl2 | Für jedes Herz |
| Lösung für die Zellresuspension (Lösung 6) | 13 mL Lösung 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) in einer Dosis, die eine dünne Schicht bilden kann, die die Oberfläche der Flüssigkeit bedeckt | Für jedes Herz |
