Isolierung von interstitiellen Zellen der Mausklappe: Eine enzymatische Methode zur Isolierung und Kultivierung von VICs aus der Aortenklappe der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Bouchareb, R. et al. Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von interstitiellen Zellen der Aortenklappe aus dem Herzen einer erwachsenen Maus mit einem zweistufigen Kollagenase-Verfahren und deren anschließende Kultivierung in einem geringen Volumen an Wachstumsmedien.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung vor der Isolierung von Klappenzellen aus erwachsenen Mäusen

1. Reinigen und sterilisieren Sie alle in Abbildung 1A gezeigten chirurgischen Instrumente mit 70 % v/v Ethanol und autoklavieren Sie sie anschließend 30 Minuten lang. Reinigen Sie den chirurgischen Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol.
2. Fügen Sie 500 μl Penicillin-Streptomycin zu 50 ml 10 mm HEPES hinzu. Bereiten Sie ein Aliquot von 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Halten Sie die Lösungen auf Eis.
3. Bereiten Sie 1 mg/ml und 4,5 mg/ml Kollagenaselösungen vor und verwenden Sie 5 ml jeder Lösung in 15 ml-Röhrchen, um den gesamten Vorgang durchzuführen. Zur Herstellung von 5 ml 1 mg/ml Kollagenase mischen Sie 5 mg Kollagenase mit 2,5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, fötales Rinderserum (FBS)-frei) und 2,5 ml 10 mM HEPES, ergänzt mit Antibiotika (1% Penicillin-Streptomycin aus Schritt 1.2). Die Lösungen werden durch einen 0,22 μm Filter filtriert, um jegliche Kontamination zu entfernen.
   Anmerkung: Bewahren Sie die Lösungen auf Eis auf, um die Enzyme zu schützen.
4. Erwärmen Sie die DMEM-Lösung vor der Verwendung in allen unten beschriebenen Schritten auf 37 °C. Bereiten Sie das komplette Medium vor, indem Sie DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % Natriumpyruvat, 5 ml 200 mM L-Glutamin, 1 ml Mykoplasmen-Eliminationsreagenz (siehe Materialtabelle) und 10 % FBS ergänzen.

>2. Isolierung von Ventilzellen

1. Um 10⁶ Zellen für das Experiment zu erhalten, verwenden Sie fünf 8 Wochen alte Mäuse (mindestens drei). Legen Sie die Maus zusammen mit einem kleinen Stück Seidenpapier, das mit 1 ml Isofluran getränkt ist, in eine Induktionskammer, aber lassen Sie keinen Kontakt mit dem Gewebe zu. Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist; Überprüfen Sie, ob der Zehenkneifreflex vorliegt, und schläfern Sie die Maus dann durch Zervixluxation ein. Verwenden Sie Isofluran, um Schmerzen vor der Gebärmutterhalsluxation zu lindern, da das unten beschriebene Verfahren tödlich ist.
2. Lege die Maus auf eine Präparierplattform und fixiere die Pfoten mit Kanülen, um sie an Ort und Stelle zu halten. Reinigen Sie die Brust und den Bauch mit Ethanol; Öffne den Bauch und die Brust mit einer Schere. Schneiden Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel, um die Maus zu entbluten. Perfundieren Sie das Herz mit 10 ml kaltem 1x PBS, um Blut aus dem Herzen zu entfernen.
3. Schneiden Sie das Herz ab und halten Sie 3 mm Abstand zur aufsteigenden Aorta, wie in Abbildung 1B gezeigt. Präparieren Sie die Aortenklappe unter einem Stereomikroskop. Schneiden Sie das Herz horizontal in der Mitte der Ventrikel ein (Abbildung 1C). Schneiden Sie den linken Ventrikel in Richtung Aorta und präparieren Sie vorsichtig die Aortenklappe (Abbildung 1D-F). Fassen Sie die Ventile in einer kleinen 35-mm-Gewebekulturschale zusammen.
4. Waschen Sie die isolierten Ventile in einer 75-mm-Zellkulturschale mit 5 ml kaltem HEPES (10 mM), ergänzt mit Antibiotika (1 % Penicillin-Streptomycin), um Blut zu entfernen (Abbildung 2). Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen mit Kollagenase 1 mg/ml und 4,5 mg/ml vor, wie oben in Schritt 1.3 beschrieben.
   Anmerkung: Manipulieren Sie nach der Dissektion die isolierten Ventile in einer sterilen Biosicherheitshaube, um die Kontamination zu minimieren.
5. Inkubieren Sie die Ventile 30 Minuten lang bei 37 °C bei 37 °C unter ständigem Schütteln (Abbildung 2). Zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 150 × g, waschen Sie das Pellet einmal mit 2 mL HEPES (10 mM) und wirbeln Sie es 30 s lang bei hoher Geschwindigkeit. Gießen Sie den Inhalt dieses Röhrchens in eine 35-mm-Kulturschale und übertragen Sie die Gewebefragmente vorsichtig mit einer dünnen Pinzette in ein neues Röhrchen.
   Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt sind die VICs noch nicht vom Gewebe dissoziiert, und das Pellet enthält Gewebestücke. Um eine Kontamination mit Endothelzellen zu vermeiden, zentrifugieren Sie nach dem Vortexen in Schritt 2.5 nicht.
6. Inkubieren Sie das Pellet in einem 15-ml-Röhrchen mit 5 mL Kollagenase Typ I (4,5 mg/ml) bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren für 35 Minuten. Suspendieren Sie die Zellen erneut mit einer 1-ml-Pipette, um die Zellen zu trennen, und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 150 × g bei 4 °C.
7. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 2 ml vollständigem DMEM. Zentrifugieren Sie bei 150 × g für 5 min bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um die Zellen zu reinigen.
   Anmerkung: Das Pellet wird noch einige Gewebefragmente enthalten.
8. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 1 ml vollständigem Medium und plattieren Sie die Zellen in einer Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturschale mit einer minimalen Menge Medium, um ihre Anheftung an die Kulturschale zu erleichtern. Lassen Sie die Zellen ungestört in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.
9. Überprüfen Sie die Zellen nach 3 Tagen unter dem Mikroskop, um ein gutes Wachstum in der Nähe der Gewebetrümmer zu gewährleisten. Sobald 1.000 Zellen unter dem Mikroskop sichtbar sind, entfernen Sie vorsichtig die Gewebereste mit einer autoklavierten Pinzette und wechseln Sie das Medium.
   Anmerkung: Die Platte sollte nicht gestört werden; Wenn die erforderliche Anzahl von Zellen nicht eingehalten wird, stellen Sie die Zellkulturschale für weitere 2 Tage wieder in den Inkubator.

Ergebnisse

Abbildung 1: Beschreibung der Ventildissektion. (ein) Repräsentatives Bild aller chirurgischen Instrumente, die für die Dissektion benötigt werden, Schere 2 wird benötigt, um die Haut der Maus zu öffnen, und Schere 3, um den Brustkorb zu öffnen. Die Pinzette 5 und 6 werden benötigt, um die Haut zu halten und die Brust zu öffnen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3 mm Schneideschere	F.S.T	Artikel-Nr.: 15000-00
Bonn Schere	F.S.T	Nr. 14184-09
Kollagenase Typ I (125 Einheiten/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Thermofischer	11965092
Extra feine Graefe-Pinzette	F.S.T	Nr. 11150-10
FBS	Gibco 16000044
Feine Pinzette	F.S.T. Dumont
HEPES 1 M Lösung	STAMMZELLEN-TECHNOLOGIEN
L-Glutamin 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Reagenz zur Eliminierung von Mykoplasmen
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
Bleistift Streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Natriumpyruvat 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Zange mit Standardmuster	F.S.T	Nr. 11000-12
Chirurgische Schere - Sharp-Blunt	F.S.T	Nr. 14008-14
Trypsin 0,05%	Thermofisher Scientific	25300054