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Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
>1. Herstellung von Methylenblau-Farbstofflösung
- Messen Sie 0,1 g Methylenblau-Pulver.
- Das Methylenblau in 10 mL normaler Kochsalzlösung oder 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Vortexen vollständig auflösen.
- Filtrieren Sie die Methylenblau-Lösung mit 10 mg/ml mit einem Spritzenfilter (Membranporengröße 0,45 μm), um Verstopfungen während der Injektion zu vermeiden.
- Montieren Sie ein steriles Kopfhautvenen-Set (27 G x 3/4") mit einer 3 mL Einwegspritze und füllen Sie die Spritze mit 3 mL gefilterter Methylenblaulösung.
Anmerkung: Um hydrostatischen Druck und nachfolgenden Farbstofffluss zu vermeiden, platzieren Sie die Nadelspitze über der mit Methylenblaulösung gefüllten Spritze.
>2. Dissektion pränataler Embryonen
- Reinigen Sie Präparierscheren und -zangen mit 70% Ethanol.
- Um perinatale Embryonen bei E18.5 oder E19.5 zu entnehmen, euthanasieren Sie trächtige Mäuse zuerst durch CO2 -Inhalation und führen Sie dann eine Gebärmutterhalsluxation gemäß den NIH-Richtlinien durch.
Anmerkung: Die schwangere weibliche Maus gebiert in der Regel ab E18,5, größere Nieren sind jedoch leichter zu manipulieren. Daher ist es einfacher, diese Analyse an Nieren mit E19,5 kurz vor der Geburt durchzuführen. Welpen mit beidseitigen Harnwegsobstruktionen sterben jedoch nach der Geburt. Abhängig von den Eigenschaften der Versuchsmäuse sollte empirisch ein geeigneter Entnahmetag/-zeitpunkt bestimmt werden.
- Sprühen Sie 70%iges Ethanol auf die ventrale Bauchfläche und öffnen Sie dann die Bauchhöhle ventral mit einer Präparierschere und einer Pinzette.
- Heben Sie die gesamte Gebärmutter an und trennen Sie sie vom Körper, indem Sie mit einer Präparierschere in die Spitzen der Gebärmutterhörner schneiden.
- Spülen Sie die gesamte Gebärmutter mit 1x PBS in einer Petrischale.
- Schneiden Sie die Gebärmutter segmental mit einer Präparierschere und entfernen Sie Plazenta-Dezidua mit einer Präparierzange, um die Embryonen in Dottersäcken freizulegen.
- Entfernen Sie zuerst den Dottersack und entfernen Sie dann die Amnionmembran mit einer Präparierzange, um die perinatalen Embryonen zu befreien.
- Enthaupte einen Embryo mit einer Präparierschere. Wischen Sie überschüssiges Blut mit sterilen Mullkissen ab. Fixieren Sie den Embryo mit seiner Bauchfläche nach oben auf ein Präpariermikroskop, das mit einer Digitalkamera für die Bildgebung ausgestattet ist. Sammeln Sie bei Bedarf seinen Schwanz für die Genotypisierung.
Anmerkung: Führen Sie Injektionen einen Embryo nach dem anderen durch.
- Öffnen Sie vorsichtig die Bauchhöhle eines Embryos mit einer Pinzette, indem Sie die Haut aufreißen. Entfernen Sie dann vorsichtig überschüssige Organe und Gewebe wie Leber, Magen und Darm mit einer Pinzette, indem Sie sie schneiden oder herausziehen, um die Nieren, die Harnleiter und die Blase freizulegen, die sich dorsal befinden (Abbildung 1A). Überschüssiges Blut aus dem präparierten Embryo wird bei Bedarf mit sterilen Mullbinden aufgenommen.
Anmerkung: Überschüssiges Blut stört die Identifizierung des Nierenbeckens für die Farbstoffinjektion.
>3. Injektion von Methylenblau-Farbstoff in das Nierenbecken und Überwachung des Farbstoffflusses
- Entfernen Sie Blasen in der Nadel und im Schlauch, indem Sie die Methylenblaulösung durch hydrostatischen Druck aus der Nadelspitze ausstoßen. Heben Sie die Spritze mit der Farbstofflösung über die Höhe der Nadelspitze, um den Fluss zu starten, und senken Sie dann die Spritze, um den Fluss zu stoppen.
- Führen Sie die Nadel in das Nierenbecken in der Nähe des proximalen Harnleiters ein und achten Sie darauf, dass sie nach dem Platzieren nicht gestört wird. Führen Sie eine Farbstoffinjektion in eine Niere durch, um die Obstruktion der Harnwege zu bestimmen.
Anmerkung: Führen Sie zuerst eine Farbstoffinjektion in eine abnormale Niere durch, indem Sie auf die gleiche Weise vorgehen, um die Obstruktion der Harnwege zu bestimmen.
- Heben Sie die Spritze etwa 20 cm nach oben, um hydrostatischen Druck zu erzeugen, und lassen Sie 15 μl bis 60 μl der Farbstofflösung fließen. Die Flussrate beträgt etwa 3 μL/s, wenn die Spritze auf diese Höhe über dem Embryo angehoben wird.
- Überwachen Sie die blaue Farbe des Farbstoffs, beginnend zuerst im Nierenbecken, dann in der Länge des Harnleiters und schließlich im Blasenlumen.
Anmerkung: Es dauert etwa 5 s, bis eine schwache Farbstofffarbe im Blasenlumen entsteht, wenn der Harnleiter richtig in die Blase eingeführt wird. Lassen Sie den Farbstoff etwa 15 s an der blockierten Stelle ansammeln, wenn keine Farbstofffarbe im Blasenlumen erscheint.
- Legen Sie die Spritze nach unten, um den Farbstofffluss zu stoppen, und entfernen Sie die Nadel aus der Niere.
- Nehmen Sie Bilder der Niere, des Harnleiters und der Blase auf, die mit Farbstofflösung verfolgt wurden, indem Sie die Kamera und das Bildgebungsprogramm verwenden, die mit einem Stereomikroskop verbunden sind.
- Notieren Sie die Hydronephrose der Niere, des Hydroureters und die endgültige Position der Farbstofflösung in einem Labornotizbuch.
- Die Injektion der kontralateralen Niere wird wie in den Schritten 3.1 bis 3.5 beschrieben durchgeführt und der Farbstoff wird insgesamt etwa 20 s fließen lassen.
Anmerkung: Das Blasenlumen wird mit Farbstofflösung gefüllt, die durch eine starke blaue Farbe gekennzeichnet ist, wenn der Harnleiter richtig in das Blasenlumen eingeführt wird. Nach der Beurteilung der Obstruktion des Harnwegsübergangs können die Harnleiter und die Blase für die Sektion fixiert werden.
