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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Tiere
Halten - Sie erwachsene 3 bis 6 Wochen alte weibliche Mäuse in einem Raum mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit (mit Phasen von 12L:12D und ad libitum gefüttert).
- Injizieren Sie Mäusen intraperitoneal 2,5 IE Trächtige Stutenserumgonadotropin (PMSG), um das Follikelwachstum zu stimulieren, indem die Wirkung des follikelstimulierenden Hormons (FSH) nachgeahmt wird. Isolieren Sie die Eierstöcke für die Entnahme von antralen Eizellen 48 Stunden später. Euthanasieren Sie die weibliche Maus, der zuvor PMSG injiziert wurde, gemäß den Standardrichtlinien.
- Entfernen Sie schnell die Eierstöcke aus der Körperhöhle und legen Sie sie in die Petrischale mit M2-Medium für die anschließende Isolierung der Eizellen (siehe Abschnitt 3).
- Machen Sie einen Schnitt in der Haut, die die Bauchdecke bedeckt, gefolgt von einem Schnitt im Bauchfell mit einer sterilen Dissektionsschere. Öffnen Sie den Schnitt, um den Bauch freizulegen, bewegen Sie die Eingeweide mit einer sterilen Pinzette auf einer Seite und lokalisieren Sie die Eileiter, wobei Sie von der Blase ausgehend eine V-Form bilden.
- Beobachten Sie die Eierstöcke, die sich unterhalb der Nieren befinden. Halten Sie jedes Röhrchen mit einer sterilen Pinzette fest und machen Sie einen kleinen Schnitt an der Unterseite der Eierstöcke, um sie zu lösen. Übertragen Sie beide Eierstöcke auf den Boden einer Petrischale, die voräquilibriertes Medium enthält.
>2. Hormonpräparation
- PMSG (in verschiedenen Stammkonzentrationen erhältlich) mit steriler isotonischer Kochsalzlösung verdünnen, um eine Arbeitskonzentration von 2,5 I.E. Hormon pro 0,1 mL für ein angemessenes Injektionsvolumen zu erhalten.
Anmerkung: Hormonlösungen müssen in 0,5-ml-Röhrchen aliquotiert und bis zum Tag der Anwendung bei -20 °C gelagert werden. Verdünnte Aliquote dürfen nicht länger als drei Monate bei -20 °C aufbewahrt werden. Lagern Sie nach dem Auftauen, wenn serielle Injektionen durchgeführt werden, die Aliquots der Hormonlösungen bei +4 °C und verwenden Sie sie innerhalb von 4 Tagen.
>3. Isolierung von antralen Eizellen
Für eine korrekte Isolierung der Eizellen:
- M2-Medium (M2) bei 5 % CO2 und 37 °C für mindestens 1 h äquilibrieren, bevor mit der Isolierung der Eizellen begonnen wird. Bereiten Sie zwei Petrischalen (35 mm x 10 mm) vor, eine mit 1 ml M2 für die Punktion der Eierstöcke und die zweite mit kleinen Tropfen (20 μl) M2, die mit Mineralöl (~1,5 ml) bedeckt sind, für den Eizelltransfer nach der Isolierung aus dem Eierstock (siehe Schritte 3.4–3.6). Halten Sie beide Petrischalen im Inkubator bei 5 % CO2 und 37 °C, bis sie einsatzbereit sind.
- Verwenden Sie ein Stereomikroskop bei der Isolierung von Eizellen.
- Bereiten Sie dünne Mundglaspipetten vor, um die Eizellen zu sammeln, indem Sie die horizontal gehaltenen Glaspasteurpipetten (halten Sie die Enden der Pipette mit beiden Händen) über eine vertikale Flamme dehnen, die vom Bunsenbrenner ausgeht (Abbildung 1).
- Sobald das Glas zu schmelzen beginnt, nehmen Sie die Pipette aus der Flamme und führen Sie eine schnelle Zugbewegung aus, um die gewünschte Pipette zu erhalten. Schneiden Sie das überschüssige Glas mit den Fingernägeln in der Nähe der schmalen Spitze der Pipette fest, um die Länge und den Durchmesser der inneren Kapillare anzupassen. Achten Sie darauf, dass die dünne Kapillare einen Innendurchmesser von ~100 μm hat, etwas größer als der Durchmesser der Eizelle (~80 μm).
- Um eine Mundpipette zu machen, verbinden Sie ein Ende des Aspiratorrohrs mit einer geeigneten Spitze mit der gezogenen Pipette und legen Sie das andere Ende in den Mund und befestigen Sie es mit den Zähnen.
- Entnehmen Sie die Eierstöcke mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie auf den Boden einer Zellkultur-Petrischale (35 mm x 10 mm). Bedecken Sie sie mit 1 ml M2, das zuvor bei 37 °C und 5 % CO2 äquilibriert wurde (Abbildung 2).
- Punktieren Sie die antralen Follikel der Eierstöcke vorsichtig mit einer sterilen Insulinspritzennadel, um antrale Eizellen in M2 freizusetzen (Abbildung 3).
- Führen Sie die Eizellen vorsichtig durch eine schmale Pasteurpipette, um Follikelzellen und andere mögliche Gewebeablagerungen zu entfernen (Abbildung 4A), und legen Sie sie dann auf den Boden kleiner Tropfen (20 μl) M2, die mit Mineralöl bedeckt sind, das für die Embryokultur geeignet ist (zuvor vorbereitet; Abbildung 4B).
Anmerkung: Es ist wichtig, alle Kumuluszellen, die an der Zona pellucida der Eizellen haften, durch kontinuierliches Pipettieren durch mehrere und verschiedene Tropfen M2 zu entfernen. Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich durch, um Veränderungen des pH-Werts des Mediums zu vermeiden.
