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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Doppelte Harzinjektionen
- Präparat
- Bereiten Sie die Harzlösung vor. Bereiten Sie für Doppelsystem-Harzinjektionen sowohl gelbe als auch grüne Harze vor, wie in den Schritten 1.1.2-1.1.4 beschrieben.
- Bereiten Sie 1 ml Aliquote verdünntes Harz pro Maus vor.
- Gelbes Harz: Verdünnen Sie gelben Silikonkautschuk (hohe Röntgensichtbarkeit) mit dem klaren Verdünnungsmittel in einer 3:1-Verdünnung, um gelbes Harz für die Injektion vorzubereiten.
- Grünes Harz: Mischen Sie blauen Silikonkautschuk (nicht nachweisbare Röntgensichtbarkeit) mit dem klaren Verdünnungsmittel in einer 1:1-Verdünnung, um blaues Harz herzustellen. Um grünes Harz zu erzeugen, mischen Sie das verdünnte blaue Harz mit dem verdünnten gelben Harz im Verhältnis 1:1. Das grüne Harz gründlich einreiben, bis die Farbe homogen ist.
Anmerkung: Blaues Harz hat eine sehr geringe Röntgensichtbarkeit, die mit der Mikro-CT nicht nachweisbar ist, so dass eine Verdünnung mit gelbem Harz erforderlich ist, um zwei Harze mit unterschiedlichen Röntgensichtbarkeiten zu erzeugen.
Vorsicht: Harz kann Bleichromat enthalten, das krebserregend ist. Bei einem Brand entstehen giftige Gase. Gehen Sie vorsichtig damit um und entsorgen Sie das Harz als Sondermüll.
- Bereiten Sie zwei Injektionssätze (Injektionsset #1 und Injektionsset #2) mit Schlauch vor, wie in den Schritten 1.1.6-1.1.11.
beschrieben
Anmerkung: Für adulte Mäuse (>P30 (postnataler Tag 30) = P30 - 2 Jahre) verwenden Sie das Injektionsset #1 (PE10-Schlauch mit 0,6 mm Außendurchmesser) für die gemeinsame Gallengangsinjektion und das Injektionsset #2 (PE50-Schlauch mit 0,96 mm Außendurchmesser) für die Pfortaderinjektion. Für junge postnatale Mäuse (bis P30) bereiten Sie zwei #1 Injektionssets vor, eines für den Gallengang und eines für die Pfortaderinjektion (kein Injektionsset #2, da die Pfortader zu eng ist, um PE50-Schläuche aufzunehmen).
- Um das Injektionsset #1 vorzubereiten, schneiden Sie 30 cm PE10-Schlauch ab und dehnen Sie ein Ende des Schlauchs mit der Hand, indem Sie daran ziehen, bis es so dünn wie möglich wird (Abbildung 1A,B, ca. 0,15 mm Durchmesser, nicht gedehnter PE10-Schlauch hat einen Durchmesser von 0,6 mm).
- Schneiden Sie die Spitze des gedehnten PE10-Schlauchs diagonal ab, um eine abgeschrägte Spitze zu erhalten (Abbildung 1B).
- Verbinden Sie das nicht gedehnte Ende des PE10-Schlauchs mit einer 30-G-Nadel (Abbildung 1A, Injektionsset #1).
- Zur Vorbereitung des Injektionssets #2 schneiden Sie 30 cm PE50-Schlauch ab und dehnen Sie ein Ende des Schlauchs mit der Hand, indem Sie daran ziehen, bis es dünn genug ist, um in die Pfortader zu passen (Abbildung 1A,B, ca. 0,7 mm, nicht gedehnter PE50-Schlauch hat einen Durchmesser von 0,96 mm).
- Schneiden Sie die Spitze des gedehnten PE50-Schlauchs diagonal ab, um eine abgeschrägte Spitze zu erhalten (Abbildung 1B).
- Verbinden Sie das nicht gedehnte Ende des PE50-Schlauchs mit einer 23-G-Nadel (Abbildung 1A, Injektionsset #2).
Anmerkung: Jedes Injektionsset kann nur für eine Injektion verwendet werden, da das Harz in der Spritze und im Schlauch aushärtet. Passen Sie die Größe der gestreckten und abgeschrägten Spitze basierend auf der Größe des gemeinsamen Gallengangs und der Pfortader der Maus an, abhängig von ihrem Alter, Genotyp und Phänotyp. Wenn Sie sich über die Größe und Passform des Schlauchs nicht sicher sind, führen Sie den Schlauch nach dem Einschnitt und bevor der Schlauch mit Harz gefüllt wird, in den entsprechenden Kanal oder das entsprechende Gefäß ein. Wenn der Schlauch zu breit ist, um in den Kanal/Behälter zu passen, dehnen Sie ihn weiter.
- Betäuben Sie das Tier durch Isofluran-Inhalation (zuerst 4% in der Induktionskammer und ~2% mit dem Nasenkonus).
- Platzieren Sie die Maus auf einer belüfteten Bank auf einem Präparierpad, während die Maus Isofluran durch den Nasenkegel einatmet. Stellen Sie sicher, dass das Tier bewusstlos ist, indem Sie eine vom Institut/IRB empfohlene Methode anwenden, z. B. indem Sie eine der Pfoten kneifen.
Vorsicht: Isofluran kann beim Einatmen Schläfrigkeit oder Schwindel verursachen und bei längerer oder wiederholter Exposition das Herz-Kreislauf-System und das zentrale Nervensystem schädigen. Atmen Sie es nicht ein. Behandeln Sie die Substanz auf einer belüfteten Bank und in gut belüfteten Bereichen.
Anmerkung: Es ist möglich, eine andere Anästhesiemethode anzuwenden, sofern sie mit der Herzperfusion vereinbar ist.
- Sobald das Tier bewusstlos ist, besprühen Sie die Bauchseite mit 70 % Ethanol, um eine Beeinträchtigung durch das Fell zu verhindern.
- Schneiden Sie mit einer Hautschere die Haut-, Faszien- und Muskelschicht beginnend an der Mittellinie der Bauchhöhle und durchschneiden Sie sie bis zur Brusthöhle, um die inneren Organe freizulegen.
- Fassen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette, um das Brustbein anzuheben, und schneiden Sie das Zwerchfell und den Brustkorb auf beiden Seiten durch, um Herz und Lunge freizulegen.
- Entferne den Brustkorb, indem du die Rippen links und rechts des Brustkorbs mit einer Schere durchschneidest. Achten Sie besonders darauf, die Leber nicht zu schädigen, da dies zum Auslaufen des Harzes führt.
- Ziehen Sie das Herz mit einer geraden Pinzette in Richtung Leber und schneiden Sie den rechten Vorhof ab.
- Führen Sie eine Schmetterlingsnadel (23 G), die mit einer peristaltischen Perfusionspumpe verbunden ist, in den linken Ventrikel ein. Perfundieren Sie die Maus transkardial mit Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) und Heparin (1 U/g Körpergewicht der Maus). Perfusion für 3 min mit einer Perfusionsrate von 5 mL/min.
Anmerkung: Wenn die Maus richtig durchblutet wird, werden die inneren Organe blass, insbesondere die Leber. Wenn sich die Lunge stattdessen weiß verfärbt, wird die Nadel in die rechte Herzkammer eingeführt und sollte neu positioniert werden. Nach der Perfusion wird die Maus exsanguiniert und kann aus dem Nasenkonus und Isofluran entfernt werden.
- Schalten Sie die Isofluranpumpe aus.
2. Harzinjektion - Harzgießen im Gallensystem
- Bewegen Sie die Maus zum Seziermikroskop, den Bauch nach oben, den Schwanz in Richtung des Experimentators und den Kopf vom Experimentator weg. Die anatomischen Orientierungspunkte von Interesse sind in Abbildung 2A dargestellt.
- Lokalisieren Sie die untere Hohlvene (Abbildung 2A), indem Sie den Darm zur Seite schieben. Verwenden Sie eine Federschere, um einen kleinen Querschnitt in der unteren Hohlvene zu machen, um die Entlastung des hepatischen Gefäßdrucks zu ermöglichen (Abbildung 2Bi).
- Legen Sie den Gallengang communis und die Pfortader frei, wie in den Schritten 1.2.4 bis 1.2.6 beschrieben.
- Bewegen Sie den Darm und die Bauchspeicheldrüse mit einem mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) benetzten Wattestäbchen auf die rechte Seite (des Experimentators).
- Drehen Sie die ventrale Seite der Leber mit dem PBS-benetzten Wattestäbchen in Richtung Herz, um die viszerale Oberfläche und die hiläre Region freizulegen.
- Lokalisieren Sie den Gallengang, der von der hilären Region über die Bauchspeicheldrüse in den Darm verläuft, am Schließmuskel von Oddi (Abbildung 2Bii, gemeinsamer Gallengang mit der gelb gestrichelten Linie umrandet, schwarze Pfeilspitzen zeigen auf den Schließmuskel von Oddi)
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Leber während des gesamten Eingriffs feucht ist, indem Sie sie mit PBS besprühen.
- Befreien Sie das umliegende Gewebe (Bereich ~5 mm) mit einer geraden Pinzette aus dem Gallengang. Legen Sie einen Seidenfaden (Stärke 4-0, 0,17 mm, 3-5 cm lang) unter den gemeinsamen Gallengang (Abbildung 2Bii) und binden Sie einen losen Überhandknoten um den gemeinsamen Gallengang (Abbildung 2Biii).
Anmerkung: Wählen Sie einen Bereich für den Knoten auf halbem Weg zwischen der hilären Region und dem Schließmuskel von Oddi und in einiger Entfernung von der Pfortader, so dass die Naht nach dem Anziehen um den Gallengang communis die Pfortaderinjektion nicht beeinträchtigt.
- Halten Sie die Federschere flach gegen den Gallengang, um an der Stelle, an der der gemeinsame Gallengang in die Bauchspeicheldrüse und den Darm eintritt, neben dem Schließmuskel von Oddi einen schrägen Schnitt in den gemeinsamen Gallengang zu machen. (Abbildung 2Biv), die gelbe gestrichelte Linie umreißt den Schließmuskel der Oddi-Region, hervorgehoben durch schwarze Pfeilspitzen).
Anmerkung: Dies ist ein entscheidender Schritt. Machen Sie einen schrägen und keinen queren Schnitt und machen Sie einen Schnitt; Durchtrennen Sie nicht den Gallengang. Das Durchtrennen des gesamten Gallengangs macht das Einführen des Schlauchs sehr schwierig.
- Mischen Sie kurz vor der Anwendung 1 ml des gelben Harzes mit 50 μl des Härters (durch Befüllen und Entleeren der 1 mL-Spritze) und füllen Sie eine 1 mL Luer-Spritze mit der Harz-Härter-Mischung.
- Verbinden Sie die gefüllte Spritze mit dem Schlauch (Set #1). Drücken Sie auf den Kolben, um den Schlauch vollständig zu füllen. Stellen Sie sicher, dass die Mischung aus Harz und Härter von der Spitze des Schlauchs tropft.
Anmerkung: Vermeiden und entfernen Sie Blasen in der Spritze und im Schlauch, um beste Ergebnisse zu erzielen.
- Begradigen Sie mit einer Pinzette den Bereich um den Schnitt des Gallengangs und führen Sie den Schlauch in die Öffnung im gemeinsamen Gallengang ein (Abbildung 2Bv), wobei die längste Kante der abgeschrägten Spitze nach unten zur dorsalen Seite des Gallengangs zeigt. Diese Ausrichtung stellt sicher, dass das Harz aus der nach oben gerichteten Schlauchöffnung in den Kanal austreten kann (Abbildung 2Bv).
- Ziehen Sie den Seidenfadenknoten fest, um den Schlauch im gemeinsamen Gallengang zu befestigen (Abbildung 2Bvi).
- Injiziere das Harz in den gemeinsamen Gallengang. Beobachten Sie die Gallenblase und die einzelnen Leberlappen.
- Massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz gleichmäßig zu verteilen. Die mit Harz gefüllten Endäste der Gallengänge (bei Wildtyp-Mäusen) sind an der Leberoberfläche schwach sichtbar.
Anmerkung: Die erwartete Zeit, um die Leber zu füllen, beträgt 30-100 s.
- Beenden Sie die Injektion des Harzes, wenn Kunststoffpunkte an der Oberfläche der Leber erscheinen (Abbildung 2Ci, blaue Pfeilspitzen) oder wenn Widerstand erreicht ist.
Anmerkung: Arbeiten Sie so schnell wie möglich, da das Harz nach der Zugabe des Harzhärters zu härten beginnt. Die Arbeitszeit ab Zugabe des Härters beträgt ca. 15 min.
- Entferne den Schlauch, indem du ihn aus dem gemeinsamen Gallengang herausziehst und den Seidenknoten mit einer Pinzette schnell festziehst, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Schneiden Sie die losen Enden der Seidennaht ab, damit sie die Pfortaderinjektion nicht beeinträchtigen.
- Entsorgen Sie den harzhaltigen Schlauch und das restliche Harz in den Sondermüll und die Nadel in den scharfen Abfällen.
