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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Präparieren des Sinusknotens (SAN)
- Bereiten Sie heparinisierte Complete Tyrode-Lösung für die SAN-Dissektion vor.
- Geben Sie 400 μl Heparin (1.000 USP/ml) zu 40 mL Complete Tyrode's Lösung und erwärmen Sie es in einem 37 °C heißen Wasserbad.
- Injizieren Sie der Maus intraperitoneal 200-300 μl Heparin (1000 USP/ml) und lassen Sie das Tier 10 Minuten lang sitzen.
- Euthanieren Sie die heparinisierte Maus durch Isofluran-Überdosierung.
- Stellen Sie die Maus in eine kleine Glaskammer, die Isoflurandämpfe enthält, die durch Zugabe von 200-300 μl flüssigem Isofluran zu einem Filterpapier in einem perforierten Kunststoffrohr erzeugt werden.
HINWEIS: Da Isofluran Hautreizungen verursachen und auch über die Haut aufgenommen werden kann, sollte die Flüssigkeit nicht direkt mit der Maus in Kontakt kommen. Daher wird das mit Isofluran getränkte Tuch zur Verabreichung in eine perforierte Tube gegeben.
- Der Tod wird durch Einstellung der Bewegung und der Atemanstrengung sowie durch das Fehlen eines Zehenkneifreflexes festgestellt. Der Tod dauert in der Regel etwa 1-2 Minuten nach dem Einsetzen in die Kammer.
Anmerkung: Der Tod geht in der Regel mit Wasserlassen einher.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage mit ausgestreckten Pfoten auf ein Sezierbrett und fixieren Sie die Pfoten mit 1 Zoll langen 23-Gauge-Spritzennadeln auf dem Brett. Entfernen Sie dann das Fell in der Nähe der Unterseite des Brustkorbs mit einer chirurgischen Schere und schneiden Sie das Fell an der Wurzel ab.
Anmerkung: Für ein Sezierbrett können Kühldeckel aus Polystyrol verwendet werden.
- Während Sie die Haut mit einem Hämostaten halten, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Querschnitt in die Haut direkt unter der Unterseite des Brustkorbs etwa vom linken Rippenbogen zum rechten Rippenbogen zu machen (Abbildung 1A).
- Schneiden Sie das Peritoneum mit einer chirurgischen Schere auf und trennen Sie die Leber vorsichtig vom Zwerchfell, wobei Sie darauf achten sollten, die Leber nicht einzukerlen, was zu übermäßigen Blutungen führen kann (Abbildung 1B). Schneiden Sie das Zwerchfell entlang des Thorax, um die Brusthöhle freizulegen (Abbildung 1C-D).
- Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Seitenwände des Brustkorbs von den Rändern der Rippenbögen bis zu den Schlüsselbeinen ab, um das Herz freizulegen, und achten Sie darauf, das Herz nicht zu beschädigen (Abbildung 1D). Verwenden Sie dann eine 23-Gauge-Spritzennadel, um den Brustkorb über die Schulter zu stecken und ihn an Ort und Stelle und außerhalb des Operationsfeldes zu halten.
- Verwenden Sie eine Transferpipette, um die heparinisierte Complete Tyrode-Lösung mit einer Transferpipette auf das Herz zu tropfen, um es feucht zu halten.
Anmerkung: Lassen Sie das Herz nicht austrocknen.
- Entfernen Sie die Lunge, indem Sie sie mit einer extra feinen Graefe-Zange festhalten und die Luftröhre mit einer chirurgischen Schere durchtrennen (Abbildung 1E).
- Halten Sie die Herzspitze mit einer extra feinen Graefe-Pinzette fest und entfernen Sie sie, indem Sie die Aorta und die Venae cavae mit einer chirurgischen Schere durchtrennen. Übertragen Sie das Herz in eine Petrischale, die ausgehärtetes Silikonelastomer enthält (Abbildung 2A), und baden Sie das Herz mit einer Transferpipette mit 2-3 ml warmer (37 °C) heparinisierter Tyrode-Komplettlösung.
Anmerkung: Achten Sie darauf, die empfindliche hintere Wand der rechten Vorhöfe, in der sich das SAN befindet, und die damit verbundenen rechten Vorhofvenen nicht zu beschädigen. Das Baden des Herzens mit der Lösung von Complete Tyrode verhindert, dass das Herz austrocknet, aber tauchen Sie das Herz nicht vollständig in Lösung, da dies die Sicht während der Dissektion beeinträchtigt.
- Richten Sie das Herz so aus, dass der rechte Vorhof auf der rechten Seite des Experimentators und der linke Vorhof auf der linken Seite des Experimentators liegt.
Anmerkung: Die Dissektion des SAN-Gewebes sollte schnell erfolgen, um ischämiebedingte Verletzungen zu vermeiden.
- Befestigen Sie die Spitze des Herzens mit einer Seziernadel an der Schale. Während Sie dann die untere Hohlvene mit einer Dumont #2 Laminektomiezange halten, führen Sie eine 22-G-Spritzennadel durch die untere und obere Hohlvene ein, um ihre Position im rechten Vorhof zu lokalisieren, der auch die ungefähre Position des SAN identifiziert (das sich im Gewebefleck zwischen der unteren und oberen Hohlvene befindet (Abbildung 2B).
- Stecken Sie mit kleinen Präpariernadeln das linke und das rechte Vorhofanhängsel an die Schale.
- Während Sie das linke Vorhofohr mit einer Dumont #2 Laminektomie-Pinzette halten, führen Sie einen Präparierstift durch das linke Vorhofohr, um es an Ort und Stelle zu halten.
- Während Sie das rechte Vorhofohr mit einer Dumont #55 Pinzette halten, führen Sie einen Präparierstift durch das rechte Vorhofohr, um es an Ort und Stelle zu halten.
Anmerkung: Die gleiche Art von Pinzette kann auf Wunsch verwendet werden, um das linke und rechte Vorhofohr zu halten.
- Entfernen Sie die Spritzennadel, die die Hohlvene überspannt.
- Um Blut aus dem Herzen abzulassen, verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um die Spitze des Herzens (d. h. die untere Hälfte) zu entfernen, indem Sie einen Querschnitt über die Ventrikel machen (Abbildung 2C). Waschen Sie dann das Herz, indem Sie warme (37 °C) heparinisierte Complete Tyrode-Lösung mit einer Transferpipette hinzufügen.
- Verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um entlang des atrioventrikulären Septums zu schneiden, wobei der Schnitt näher am Ventrikel als an den Vorhöfen gehalten wird. Fahren Sie mit dem Schnitt entlang des atrioventrikulären Septums fort, bis die Vorhöfe von den Ventrikeln getrennt sind.
- Entlang des interatrialen Septums schneiden, um den linken Vorhof zu entfernen.
- Platzieren Sie Präpariernadeln in der Peripherie des rechten Vorhofs, damit er flach liegt (Abbildung 2D). Entfernen Sie mit der Castroviejo-Schere restliches Fett, Gefäße oder Gewebe aus dem Vorhof.
- Platzieren Sie das SAN im rechten Vorhof, der in dieser Ausrichtung ungefähr von der oberen Hohlvene (oben), der unteren Hohlvene (unten) und den Cristae-terminalis (links) begrenzt wird (Abbildung 2D).
HINWEIS: Die Crista terminalis erscheint als dunkler Muskelkamm zwischen dem rechten Vorhofohr und dem SAN. Oft kann man auch sehen, wie die SAN-Arterie durch das SAN fließt (Abbildung 2D).
