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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von mikroosmotischen Pumpeninfusionssystemen
HINWEIS: Bereiten Sie die Pumpe, den Puffer der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) und das Medikament (Met-CCL5/RANTES-Proteinlösung (10 ng/ml in aCSF)) unter sterilen Bedingungen mit Puffern vor, die mit 0,2-μm-Filtern filtriert sind, und führen Sie alle Eingriffe unter der Kulturhaube mit Handschuhen durch. Die chirurgischen Eingriffe werden wie folgt durchgeführt:
- Bereiten Sie die mikroosmotischen Pumpen einen Tag vor der Operation vor: Füllen Sie die mikroosmotische Pumpe des Gehirns mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) mit einer 1-ml-Spritze und einer stumpfen Nadel, die zusammen mit dem Kit geliefert werden. Tauchen Sie die Mikroosmosepumpe in aCSF, stellen Sie sie auf einen Schüttler und schütteln Sie sie vorsichtig über Nacht.
ACHTUNG: Die Pumpe sollte mit aCSF gefüllt sein und Luftblasen im Inneren der Pumpe sollten vermieden werden (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie vor Beginn der Operation die rekombinante Met-CCL5/RANTES-Proteinlösung (10 ng/ml, verdünnt in aCSF) für die Verwendung im Experiment vor. Entfernen Sie aCSF aus der Pumpe und füllen Sie die Pumpe langsam mit der Arzneimittellösung, bis der Überschuss austritt.
HINWEIS: 15 mL aCSF oder Met-CCL5/RANTES Lösung sind ausreichend für 5-8 Pumpen.
ACHTUNG: Wiederholen Sie den Vorgang, um sicherzustellen, dass die Pumpe vollständig mit dem Medikament gefüllt ist und keine Blasen im Inneren vorhanden sind.
- Schneiden Sie die Katheterschläuche in die gewünschte Länge und befestigen Sie sie mit der stumpfen Hirninfusionsnadel im Gehirninfusionsset. Füllen Sie das Infusionsset und die Schläuche mit dem Medikament.
- Bauen Sie abschließend das Gehirninfusionsset zusammen und befestigen Sie es an der Mikroosmosepumpe.
ACHTUNG: Es sollten sich keine Blasen im Schlauch oder in der Pumpe bilden (Abbildung 1A).
- Tauchen Sie das gesamte osmotische Pumpen-Hirn-Fusionsset in aCSF in ein sterilisiertes 50-ml-Röhrchen, um ein Austrocknen der Pumpe zu verhindern. Das osmotische Pumpe-Hirn-Fusionsset ist nun bereit für den Einsatz in der Chirurgie.
HINWEIS: Die mikroosmotischen Pumpensysteme können für die langfristige Infusion von Medikamenten verwendet werden. Dies gewährleistet eine sichere und bequeme Art der Verabreichung von Medikamenten in das Gehirn der Maus.
>2. Intrazerebrale ventrikuläre Chirurgie – Implantation der Mikroosmosepumpe
VORSICHT: Sterilisieren Sie die chirurgische Umgebung mit 75% Ethanol und stellen Sie sicher, dass die an der Studie beteiligten Personen sterile Handschuhe und einen sauberen Laborkittel tragen. Chirurgische Instrumente/Instrumente müssen vor der Verwendung autoklaviert und getrocknet und anschließend zwischen den Mäuseoperationen mit 75 % Ethanol sterilisiert werden.
- Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie durch intraperitoneale Injektion (IP) mit Ketamin/Xylazin (Ketamin 50 mg/kg, Xylazin 10 mg/kg).
ACHTUNG: Ein Körpergewicht von Mäusen unter 24 g wird für die Implantation mit osmotischen Pumpen nicht empfohlen.
- Montieren Sie den Mauskopf und befestigen Sie ihn auf dem stereotaktischen Gerät (Abbildung 1B).
- Schneide mit einer chirurgischen Schere und einer Zange die Außenhaut auf, die den Schädel bedeckt. Verwenden Sie Jod, um den peripheren Schädel zu reinigen.
- Trennen Sie die äußerste Hautschicht von der subkutanen Haut mit Hilfe einer stumpfen Zange in der Nähe der Halsregion für die Implantation des osmotischen Pump-Hirn-Fusionssets (Abbildung 1C).
- Markieren Sie den Infusionspunkt in Bezug auf die Gehirnkarte (Abbildung 1D) mit dem stereotaktischen Gerät. In diesem Experiment muss die Nadel in den Bereich des 3. Ventrikels implantiert werden (Bregma: 0,0 mm lateral, 1,3 mm posterior, 5,7 mm ventral).
- Bohren Sie mit einem Nagelbohrer ein Loch um die auf dem Schädel markierte Stelle (Abbildung 1E).
ACHTUNG: Achten Sie darauf, die Hirnhäute und Blutgefäße der Maus nicht zu brechen, um eine Störung der Mikroblutgefäße im Gehirn zu vermeiden.
- Legen Sie das mikroosmotische Pump-Hirn-Fusionsset, das aCSF (als Kontrolle) oder Medikament (Met-CCL5/RANTES-Proteinlösung) enthält, unter die Haut hinter der Halsregion und führen Sie die Gehirninfusionsnadel in das Bohrloch ein, um das Medikament in das Gehirn der Maus zu infundieren (Abbildung 1E). Die Nadel dringt in die Hirnhäute ein und gelangt in die Herzkammer. Fixieren Sie die Nadel mit einem oberflächendesensibilisierenden Gel (Abbildung 1F) auf dem Schädel und warten Sie 1-2 Minuten, bis der Kleber getrocknet ist. Schneiden Sie dann den überstehenden Teil oben auf der Nadel ab (Abbildung 1G-H).
- Verwenden Sie einen Gewebekleber, um die Operationswunde am Kopf zu heilen. Tragen Sie 50 μl des Klebers auf die Wunde auf, ziehen Sie beide Seiten der Haut zusammen und halten Sie ihn 30 s lang gedrückt, damit die Haut sich versiegeln kann (Abbildung 1I).
ACHTUNG: Verwenden Sie ein 100%iges Alkoholpad, um die Wunde nach der Operation zu reinigen, und 100 μl Penicillin mit Streptomycin, um eine Infektion zu verhindern. HINWEIS: Die Haut von Mäusen bildet Narbengewebe und heilt in wenigen Tagen nach der Verabreichung des chirurgischen Klebers. Der Hauptvorteil des Klebers ist die Vermeidung von chirurgischen Nähten, die Hautreizungen oder Entzündungen verursachen können.
- Stellen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, der auf einer warmen Platte (bis zu 37 °C erhitzt) aufbewahrt wird, und warten Sie, bis sich die Maus von der Betäubungswirkung erholt hat.
VORSICHT: Es ist wichtig, die Körpertemperatur der Maus zu halten, um die Überlebenschancen nach der Operation zu erhöhen.
- Nach einer einwöchigen Erholungsphase sind die Mäuse bereit für weitere Experimente, wie z. B. den oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und den Insulintoleranztest (ITT).
