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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Intravitale Bildgebung
- Schalten Sie das Intravitalmikroskop inklusive der Laserleistung ein.
- Schalten Sie das Heizkissen ein und stellen Sie die homöotherme Regelung auf 37 °C.
Anmerkung: Alternativ können Sie ein passives Heizkissen oder eine Lampe mit häufiger Kontrolle verwenden, wenn keine homöotherme Regelung vorhanden ist.
- Nehmen Sie eine Maus mit vorimplantiertem Pankreasfenster. Führen Sie eine intramuskuläre Anästhesie mit einer Mischung aus Tiletamin/Zolazepam (30 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch.
Anmerkung: Die Verwendung von Tiletamin/Zolazepam wird anstelle von Ketamin empfohlen, da es eine nachteilige Wirkung von Hyperglykämie hat. Für die Zwecke der Experimente sollte die optimale Anästhesie ausgewählt werden.
- Legen Sie für die Injektion einen Gefäßkatheter an.
- Üben Sie mit dem Zeige- und dritten Finger Druck auf die proximale Seite des Schwanzes aus, als Alternative zu einer Tourniquet-Anwendung. Heizen Sie das Heck bei Bedarf mit einer Lampe.
- Sterilisieren Sie die Schwanzvene mit einem 70%igen Ethanolspray.
- Führen Sie einen 30 G Katheter in die seitliche Schwanzvene ein. Das Aufstoßen von Blut wird im PE10-Röhrchen sichtbar gemacht.
- Bringen Sie ein Seidenband auf den Katheter an, um ihn zu stabilisieren.
- Injizieren Sie FITC/TMR-Dextran oder andere Fluoreszenzsonden (25 μg Anti-CD31-Konjugat mit Alexa 647), je nach Bedarf, je nach Kombination der Fluoreszenzsonden.
Anmerkung: Bei fluoreszierenden konjugierten Antikörpersonden 2 Stunden vor der Bildgebung injizieren.
- Übertragen Sie die Maus von der chirurgischen Plattform in die Bildgebungsphase.
- Führen Sie eine rektale Sonde ein, um die Körpertemperatur mit dem homöothermen Heizkissensystem automatisch zu regeln.
- Setzen Sie das Pankreas-Bildgebungsfenster in den Fensterhalter ein, der während der Einrichtung der Intravitalmikroskopie vorbereitet wurde (Abbildung 1). Für ein inverses Mikroskop ist möglicherweise kein Fensterhalter erforderlich.
- Führen Sie eine intravitale Bildgebung durch.
- Beginnen Sie für die Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 4x), um die gesamte Ansicht der Bauchspeicheldrüse im Pankreas-Bildgebungsfenster abzutasten (empfohlenes Sichtfeld: 2500 x 2500 μm).
- Wechseln Sie nach der Bestimmung des interessierenden Bereichs zu einer Objektivlinse mit höherer Vergrößerung (20x oder 40x), um die Bildgebung auf zellulärer Ebene durchzuführen (empfohlenes Sichtfeld: 500 x 500 μm oder 250 x 250 μm). In diesem Experiment betrug die laterale und axiale Auflösung etwa 0,5 μm bzw. 3 μm.
- Führen Sie Z-Stack- oder Zeitraffer-Bildgebung durch, um die 3D-Struktur oder die Dynamik auf Mobilfunkebene, wie z. B. die Zellmigration, zu beobachten.
Anmerkung: Für die Bildgebung der fluoreszierenden Protein-exprimierenden Zellen transgener Tiere (MIP-GFP) war eine 30 s intermittierende 488-nm-Laserbelichtung mit einer Leistung von bis zu 0,43 mW ohne erkennbares Photobleaching oder Gewebeschädigung tolerierbar. Für die Bildgebung der mit Alexa 647 markierten fluoreszierenden Proteine war die Laserleistung von 640 nm bis zu 0,17 mW ohne erkennbares Photobleaching oder Gewebeschäden tolerierbar. Eine längere Stimulationslaser-Exposition mit einer Leistung über dieser Einstellung kann zu Photobleiche oder Gewebeschäden durch Phototoxizität führen. Passen Sie die angemessene Verstärkung und Leistung an, um den interessierenden Bereich angemessen abzubilden. Die detaillierte Einstellung der Parameter in der Intravitalmikroskopie muss für jede im Institut angefertigte Intravitalmikroskopie individuell angepasst werden.
