Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Antegrade Perfusion des Mausherzens
HINWEIS: Die Kunststoff-Transferpipette, die zum Saugen des Herzens verwendet wird, sollte weich sein und sich nicht scharf zur Spitze hin verjüngen. Wählen Sie eine kleine Gefäßklemme mit Verzahnung. Die empfohlenen Instrumente sind in der Materialtabelle aufgeführt.
- Exzision des Mausherzens und Abklemmen der Aorta
Anmerkung: Die adulten Mäuse (>8 Wochen alt) sollten durch eine Überdosis Natrium-Pentobarbital (>300 mg/kg, intraperitoneale [i.p.] Injektion) mit Heparin (8000 Einheiten/kg) euthanasiert werden.
- Schneiden Sie das Mausherz schnell heraus, indem Sie daran saugen.
- Öffnen Sie die Brusthöhle schnell, um das Herz freizulegen. Schneiden Sie die Transferpipette aus Kunststoff ab, deren Spitze ungefähr so groß wie das freiliegende Herz oder etwas kleiner ist (normalerweise an einer Stelle etwa 1 cm von der 0,5-ml-Markierung zur Spitze hin, aber das hängt von der Herzgröße ab).
- Saugen Sie das Herz in die Pipette, heben Sie die Pipette an, um genügend Platz für die Schere zu schaffen, und schneiden Sie das Herz mit einer gebogenen Schere von der dorsalen Seite heraus, um eine Beschädigung der Vorhöfe zu vermeiden.
- Übertragen Sie das herausgeschnittene Herz sofort in das 30-ml-Glasbecherglas mit eisgekühltem CIB-EGTA, um die Kontraktion zu stoppen. Dieser Vorgang dauert in der Regel <1 min.
- Reinigung um die Aorta herum
- Übertragen Sie das Herz in eine 35-mm-Kulturschale, die mit eisgekühltem CIB-EGTA gefüllt ist, und entfernen Sie die Lunge und anderes sichtbares Gewebe, und legen Sie dann das grob gereinigte Herz auf das mit gekühltem CIB-EGTA gefüllte Herzstativ und platzieren Sie es mit der Spitze nach unten.
- Entfernen Sie unter dem stereoskopischen Mikroskop das Fett und das Bindegewebe, um die Aorta zu reinigen. Wenn die Länge der durchtrennten Aorta einschließlich der Arteria brachiocephalis, der linken Arteria carotis communis oder der linken Arteria subclavia zu lang ist, schneiden Sie die Aorta direkt unter der Arteria brachiocephalica ab, um sie zu verkürzen und mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Dieser Vorgang dauert in der Regel ca. 4 Minuten
- Einklemmen der Aorta und Auflegen des geklemmten Herzens auf die Perfusionsplatte
- Führen Sie die Injektionsnadel ein und starten Sie die Durchblutung, um das Blut abzuleiten
- Legen Sie das Herz unter dem Mikroskop in den Herzständer. Der Bediener sollte auf die vordere Oberfläche des Herzens schauen, das Ende der Aorta mit einer Pinzette aufnehmen und die Aorta in der Nähe der Vorhöfe mit einer kleinen Gefäßklemme festklemmen, während er die Aorta leicht nach unten drückt.
- Legen Sie das geklemmte Herz mit der Frontseite nach oben auf die Perfusionsplatte und bedecken Sie es dann mit einigen Tropfen CIB-EGTA, damit es nicht austrocknet. Dieser Vorgang dauert in der Regel <20 s.
- Antegrade Durchblutung des Herzens
Anmerkung: Zuerst wird das Herz mit CIB-EGTA durchblutet, um das Blut abzuleiten und die Gerinnung zu verhindern.
- Führen Sie die Injektionsnadel ein und starten Sie die Durchblutung, um das Blut abzuleiten
- Setzen Sie die mit vorgewärmtem CIB-EGTA gefüllte 20-ml-Spritze mit dem flexiblen Verlängerungsschlauch und einer markierten Injektionsnadel auf die Infusionspumpe. Starten Sie die Pumpe mit einer langsamen Geschwindigkeit von 0,5 ml/min, um die Nadel und den Schlauch vorsichtig mit CIB-EGTA zu füllen und darauf zu achten, dass keine Luft in den Schlauch eindringt.
- Legen Sie die Injektionsnadel mit der kürzeren Seite der Diagonalform nach vorne auf die Perfusionsplatte. Schieben Sie die Nadel in Richtung der Herzspitze, bis sie sie berührt, und führen Sie die Nadel dann vorsichtig in der Nähe der Spitze des linken Ventrikels in die Ventrikelkammer ein, ohne sie zu verdrehen. Lösen Sie die Nadel nicht von der Platte, während Sie das Einführen durchführen.
- Achten Sie auf die rote Markierung, um die Tiefe des Einstechens der Nadel abzuschätzen. Wenn das Einstechen der Nadel abgeschlossen ist, sollte das aus der Koronararterie fließende Blut allmählich abfließen
.
- Befestigen Sie die Injektionsnadel mit Klebeband auf der Platte und erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 1 ml/min. Dieser Vorgang dauert in der Regel ca. 30 s. Wird das Herz erfolgreich perfundiert, kann der Fluss des CIB-EGTA in der Kapillare direkt unter dem Epikard unter dem Mikroskop gesehen werden.
