Druckfixierung einer isolierten Maus-Pulmonalklappe: ein Verfahren zur Isolierung und chemischen Fixierung der Maus-Pulmonalklappe in geschlossener Konformation

Zusammenfassung

Quelle: Liu, Y., et al. Chirurgie und Probenverarbeitung für die korrelative Bildgebung der murinen Pulmonalklappe. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Isolierung und chemischen Fixierung des Lungenwerts der Maus in geschlossener Konformation mittels Perfusionsdruckbeaufschlagung.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Exzision der Pulmonalklappe

1. Autoklavieren Sie die notwendigen Werkzeuge, die für die Maus-Dissektion benötigt werden. Dazu gehören Feinscheren, Mikrozangen, Mikrogefäßklemmen, Klemmzangen, Mikronadelhalter, Federscheren und Retraktoren.
2. Akklimatisieren Sie alle Mäuse mindestens 2 Wochen vor der Operation. Nehmen Sie C57BL/6-Mäuse im Alter von etwa 1 Jahr aus ihren Käfigen und wiegen Sie sie, dann euthanasieren Sie sie mit einer Überdosis Ketamin/Xylazin-Cocktail (3:1 Ketamin:Xylazin, 0,01 ml pro g).
3. Legen Sie die Maus in einer dorsalen Liegeposition auf ein Tablett und sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband. Sobald sie gesichert ist, führen Sie die Thorakotomie durch.
   1. Legen Sie das Herz frei, indem Sie überschüssiges Fettgewebe und Faszien entfernen.
   2. Entfernen Sie den rechten Vorhof und perfusionieren Sie durch den linken Ventrikel mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur (0,9 % NaCl). Die Perfusion sollte ca. 20 ml über 30 s dauern. Dies hat die Entblutung der Maus zur Folge.
4. Entfernen Sie das gesamte Herz, indem Sie die obere Hohlvene, die untere Hohlvene, die Lungenarterie und die Aorta durchtrennen. Besondere Vorsicht ist bei der Lungenarterie geboten. Schneiden Sie ca. 2 mm oberhalb des ventrikulo-arteriellen Übergangs, da dieser als Kanal für die Druckbeaufschlagung dient.
5. Entfernen Sie den linken und rechten Ventrikel, um die Kammern Atmosphärendruck auszusetzen. Stellen Sie sicher, dass die Struktur des Lungenstamms durch die Entfernung der Ventrikel nicht beeinträchtigt wird.

>2. Druckfixierung der Pulmonalklappe

1. Anastomosen-Druckbeaufschlagungsschlauch mit Pulmonalarterie, wobei ein Abstand von ca. 1 mm zwischen dem sino-tubulären Übergang und dem Ende des Schlauchs verbleibt, um große Bewegungen der Segel und des Lungenstamms aufzunehmen.
2. Heben Sie das Reservoir auf einen analogen physiologischen Druck an und füllen Sie es mit der Kochsalzlösung. Testen Sie das Durchflusssystem, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen oder Luftblasen vorhanden sind.
3. Befestigen Sie einen Absperrhahn an der anastomosierten Pulmonalklappe und sorgen Sie für eine ausreichende Strömung durch den Schlauch (d. h. keine Luftblasen), indem Sie den Abflusstrakt umschalten. Sobald der Durchfluss ausreichend ist, schalten Sie den Ausfluss auf die anastomosierte Pulmonalklappe um und sorgen Sie für eine Druckbeaufschlagung des Lungenstamms. Dies ist an der Dehnung des Lungenstamms zu erkennen.
4. Sobald die Druckbeaufschlagung des Lungenstamms bestätigt ist, nach und nach die primäre Fixierlösung (1,25 % Glutaraldehyd, 1,0 % Paraformaldehyd in 0,15 M Cacodylat) einarbeiten, bis die Kochsalzlösung gespült ist. Dies geschieht, indem ein Teil, etwa 25 % des Reservoirvolumens, der Kochsalzlösung entfernt und durch das primäre Fixiermittel ersetzt wird.
   Vorsicht: Die verwendeten Fixiermittel (Paraformaldehyd und Glutaraldehyd) sind hochgiftig und es sollte eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden, um die Sicherheit zu gewährleisten.
5. Legen Sie eine mit Fixiermittel getränkte Gaze über die Gewebeprobe, um ein Austrocknen zu verhindern.
6. Perfundieren Sie das Fixiermittel 3 h lang und füllen Sie den Behälter bei Bedarf auf, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Während der Fixierung ist es nicht ungewöhnlich, dass die Pulmonalklappe aufgrund der chemischen Fixierung schrumpft. Wenn dies der Fall ist, füllen Sie das Reservoir ständig mit primärem Fixiermittel auf, um den physiologischen Druck aufrechtzuerhalten.
7. Lagern Sie die Herzklappe bis zur Verwendung in der Fixierlösung bei 4 °C. Die Proben wurden bis zu 1 Woche gelagert, ohne dass ein Unterschied erkennbar war.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
25% Glutaraldehyd (aq)	ems	Artikel-Nr.: 16210	Primäre Fixierkomponente
0,9 % Natriumchlorid-Injektion	Hospira Inc.	Artikel-Nr.: 0409-4888-10
1 mL Spritze	Bd	309659
10 mL Spritze	Bd	309604
22G Nadel	Bd	305156
3-Wege-Absperrhahn	Smiths Medical ASD, Inc	MX5311L
4 % Paraformaldehyd (aq)	ems	Tel.: 157-4-100	Primäre Fixierkomponente
C57BL/6 Mäuse	Jackson Laboratorien	664	Ungefähr 1 Jahr
Klemmzange zum Anlegen	FST	00072-14
Dumont #5 Pinzette	FST	Nr. 11251-20
Dumont #5/45 Pinzette	FST	Nr. 11251-35
Dumont #7 feine Pinzette	FST	Nr. 11274-20
Feine Schere	FST	Nr. 14028-10
Kochsalzlösung (steril 0,9% Natriumchlorid)	Hospira Inc	NDC 0409-0138-22
Operationsmikroskop	Leica	M80
Tish Nadelhalter/Pinzette	Micrins	MI1540
trimmer	Wahl	9854-500
Schwarzes Polyamid-Monofilament-Nahtmaterial, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Schwarzes Polyamid-Monofilament-Nahtmaterial, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
Ketaminhydrochlorid-Injektion	Hospira Inc	NDC 0409-2053
L-Asparaginsäure	Sigma-Aldrich	56-84-8	Färbekomponente
Bleinitrat	ems	Nr.: 17900	Färbekomponente
Natriumcacodylat-Trihydrat	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 6131-99-3	Puffer
Vlies-Lieder	McKesson Corp.	Artikel-Nr.: 94442000
Micro-Adson-Pinzette	FST	Nr. 11018-12
Millex-GP Filter, 0,22 μm, PES 33mm, unsteril	EMD Millipore	SLGP033NS

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