Entnahme von weißem und braunem Fettdepot von Mäusewelpen: Ein chirurgischer Eingriff zur Entnahme von weißem Fettgewebe und braunem Fettgewebe von Mäusewelpen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Galmozzi, A. et al. Isolierung und Differenzierung von primären weißen und braunen Präadipozyten aus neugeborenen Mäusen. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video demonstrieren wir das chirurgische Verfahren zur Isolierung des subkutanen weißen Fettgewebes und des interscapularen braunen Fettgewebes einer neugeborenen Maus.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Entnahme und Verdauung von Fettdepots (Tag 1)

Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen für jeden Welpen vor: eines für braunes Fettgewebe (BAT) und eines für weißes Fettgewebe (WAT). Geben Sie 250 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 200 μl 2x Isolationspuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl₂, 5 mM Glucose, 100 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES), Penicillin-Streptomycin und 4 % fettsäurefreies Rinderserumalbumin) in jedes Röhrchen. Bewahren Sie die Lösungen steril und auf Eis auf.
Lege die Welpen in kleine Kammern (z. B. eine Vertiefung einer 6-Well-Platte) und lege sie auf Eis, bis sie unterkühlt sind. Achten Sie darauf, dass es keinen direkten Kontakt zwischen den Welpen und dem Eis gibt. Stich eine Pfote mit einer Spitze, um den Bewusstseinsverlust sicherzustellen, und euthanasiere die Welpen durch Enthauptung mit einer scharfen Schere.
HINWEIS: Wenn Sie mit verschiedenen Genotypen arbeiten, bereiten Sie ein zusätzliches Röhrchen vor, um eine Schwanzbiopsie (3 mm Schnitt) für die Genotypisierung zu entnehmen. Wenn die Genotypisierung sofort durchgeführt wird, halten Sie die euthanasierten Welpen bis zur Sektion auf Eis, um Fettdepots zu sammeln.
Berechnen und wiegen Sie die Menge an Kollagenase ab, die benötigt wird, um alle Depots zu verdauen. Geben Sie 50 μl 15 mg/ml Kollagenase Typ I in 2x Isolationspuffer in jedes Röhrchen. Resuspendieren Sie die Kollagenase nicht in einem Isolationspuffer, bis alle Gewebe entnommen wurden.
Um subkutane WAT zu sammeln, schneiden Sie die Haut um den Bauch des Welpen (vermeiden Sie eine Bauchfellruptur) und ziehen Sie die Haut vorsichtig unter die Beine. Ohne die Haut zu entnehmen, sammeln Sie vorsichtig das Fettdepot, das als klares (P1 oder jünger) oder weißes (P2 und älter), dünnes, längliches Gewebe erscheint, das an der Innenseite oder auf dem Quadrizeps befestigt ist (Abbildung 1A, B). Spülen Sie das Fettdepot in PBS und legen Sie es in eines der Röhrchen mit 250 μl PBS + 200 μl 2x Isolationspuffer. Bleiben Sie auf Eis.
HINWEIS: P0- und P1-Mäuse liefern den besten Ertrag. Bei P0-1-Welpen ist das subkutane WAT-Depot nahezu transparent. Bei P2-Mäusen und älteren Mäusen ist das Depot leichter zu identifizieren, da es bereits weiß wird, was auf das Vorhandensein voll ausgereifter, lipidgeladener, weißer Adipozyten hinweist.
Um interscapulares BAT zu sammeln, ziehen Sie die Haut von den Schulterblättern über den Kopf. Heben Sie den BAT - das tiefrote Gewebe zwischen den Schulterblättern - an und schneiden Sie vorsichtig rundherum, um es vom Körper zu lösen (Abbildung 1A, B). Überprüfen Sie auf Konsistenz und Farbe; Spülen mit PBS; Legen Sie es in das andere Röhrchen mit 250 μl PBS + 200 μl 2x Isolationspuffer; Und weiter auf Eis.
HINWEIS: Bei der Entnahme von BVT von P2-Mäusen und älteren Mäusen ist das weiße Fettgewebe, das die BAT umgibt, vorsichtig zu entfernen. Es besteht aus einer dünnen, weichen, weißen Schicht aus Adipozyten, die sich zwischen der Haut und dem BAT befindet und tiefer zwischen den Schulterblättern liegt.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Entnahme und Verarbeitung von Fettpolstern. (A) Schematische Darstellung der primären Isolierung von weißen (oben) und braunen (unten) Adipozyten. (B) Subkutane weiße (oben) und braune (unten) Fettdepots. Bei P0-Mäusen ist subkutane WAT fast unsichtbar, wird aber am ~Tag 2 nach der Geburt unterscheidbar. Im Gegensatz dazu hat BAT auch bei P0 eine deut...